猪生殖与呼吸综合征病毒5′非翻译区序列的反向遗传操作

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美株感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR获得在病毒基因组5′非编码区(5′UTR)和ORF1起始密码子之间插入NdeⅠ的全长克隆pTLNd4,并以此为基础将5′UTR替换为欧洲株的5′UTR,获得全长克隆pTLV8。以体外转录的RNA转染MARC-145细胞。结果显示,pTLNd4产生了细胞病变(CPE),而pTLV8未产生。通过RT-PCR和Northern blot试验,分别对这2株突变病毒的基因组RNA复制和亚基因组mRNA转录水平进行了分析,同时还对pTLNd4进行了病毒学试验。证实,它们与亲本病毒无论从分子生物学水平或病毒学水平都无明显差异;pTLV8虽未产生CPE,但在病毒传代细胞中检测到了基因组RNA,说明替换不同基因型5′UTR的突变病毒虽然丧失了复制能力和感染性,但仍然能够提供病毒RNA合成所需要的顺式调控因子。     

通过基因组合成构建美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆

根据已测定的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GSWW分离株的全长基因组序列信息,采用合成生物学的方法,将全长基因组序列分为两段(7 636 bp和7 774 bp)分别连接到低拷贝载体p BR-322载体中,然后将2个半长片段相连接得到全长c DNA克隆。将质粒线性化后,体外转录获得全长RNA,经电穿孔转染BHK21细胞拯救获得了初代病毒。将初代病毒接种感染Marc-145细胞进行传代,接毒后第36小时即可观察到完全的致细胞病变效应(CPE)。通过RT-PCR、间接免疫荧光、测序验证,证明成功获得了PRRSV GSWW株的感染性克隆。通过实时荧光定量法检测拯救病毒与原田间分离毒的复制能力,没有显著差异,采用实时荧光定量法测得的拯救病毒复制的最高效价为1×1010copies/m L。本研究表明,采用长片段基因合成的方法进行PRRSV感染性克隆的构建,方法可行且速度快,为PRRSV流行毒感染致病机理、免疫机制和基于反向遗传学的新型疫苗研制提供了重要的分子工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

口蹄疫病毒Asia 1/JSWX株基因组全长感染性克隆的体外拯救与序列分析

通过反转录聚合酶链反应,获得了口蹄疫病毒(FMDV)Asia1/JSWX株基因组3′端长片段(长约7.5kb)和5′UTR中ploy(C)前后的2个短片段。5′UTR的2个短片段经融合PCR扩增得到长约710bp的片段。用引物在基因组5′末端引入AflⅡ酶切位点和T7启动子,在5′UTR内引入SpeⅠ酶切鉴定位点,在3′末端引入NotⅠ酶切位点,将融合片段和3′端长片段顺次连接到载体pSL1180。经T7体外转录系统获取的RNA转录本与脂质体共转染BHK21细胞。测序结果表明,构建的病毒基因组全长cDNA为8 197nt,分别包括1个长为1 095nt的5′UTR[含有1个17nt的ploy(C)];1个长6 990nt的ORF;1个长为93nt的3′UTR;之后是18nt的poly(A)尾巴。该全长cDNA克隆与Asia 1/Jiangsu/China/2005株基因组序列的同源性为98.4%。测序和酶切鉴定结果均表明,该口蹄疫病毒株全长cDNA克隆已构建成功,该方法极大地简化了获得FMDV全长cDNA克隆的过程。通过反转录聚合酶链反应、间接免疫荧光试验和蚀斑试验等鉴定,本试验获得了感染性分子克隆;体外拯救获得的基因工程病毒连续传代培养后,可致BHK21细胞产生病变。上述结果表明,构建的cDNA克隆可以作为基因操作的载体,为深入研究安全性好、稳定性高和免疫原性强的基因工程疫苗奠定了基础。     

新城疫病毒La Sota疫苗株基因组全长cDNA克隆的构建及鉴定

为构建能为新城疫病毒拯救提供直接使用的全长cDNA克隆,利用分子克隆的方法,将新城疫病毒La Sota株全基因组分成末端部分重叠的11个片段(F1～F11),按其基因组顺序克隆至改造后的真核表达载体pVAXr上,同时在全长cDNA两侧引入T7启动子和丁型肝炎病毒核酶(Rib)序列,以确保病毒基因组转录产物的两端形成精确的核酸序列。鉴定结果表明,新城疫病毒La Sota株基因组全长cDNA已成功克隆至pVAXr上,命名为pVAXr-FL。本研究为新城疫病毒的拯救及外源基因的表达奠定了基础。     

表达流行毒株VP2蛋白的IBDV重组疫苗株rGtHLJVP2的构建及其免疫效力的评价

为应对传染性法氏囊病病毒(IBDV)变异毒株及超强毒株(vvIBDV)等突发疫情的出现,解决传统疫苗株筛选费时费力的难题,在流行病学调查的基础上,克隆了超强毒株HLJ0504的VP2基因,并突变细胞嗜性决定氨基酸位点(Q253H/A284T),用其替换IBDV弱毒株Gt基因组的相应区段,成功获得1株表达流行vvIBDV VP2蛋白的重组病毒rGtHLJVP2。体内、外复制动力学研究表明,该重组病毒与亲本病毒Gt的复制能力相当。动物试验结果表明,该重组病毒对接种鸡无明显致病性,接种鸡法氏囊指数均在0.7以上,法氏囊无明显萎缩现象。该重组病毒可以诱导机体产生良好的免疫应答,其抗体水平明显高于亲本毒,能够完全抵抗vvIBDV的攻击。另外,该重组病毒具有良好的遗传稳定性。本研究结果为新型传染性法氏囊病疫苗的研发奠定了基础,对于IBDV突发疫情的应急防控具有重要意义。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

猪源乙型脑炎病毒HEN0701株全基因组的分子特征

将乙型脑炎病毒HEN0701株基因组RNA分4段进行RT-PCR扩增,并克隆入pCRⅡ-Blunt-TOPO载体中,测定全长cDNA序列。以MapDraw软件分析了乙型脑炎病毒HEN0701株的基因组结构,并将病毒基因组分成2个非编码区和10个基因,比较了HEN0701株和11株乙型脑炎病毒在全基因组和各基因的核苷酸及推导氨基酸的同源性。以MEGA5软件绘制HEN0701株和11株病毒C、E、NS3、NS5基因的进化树。结果显示,HEN0701株全基因组为10 965 nt,包含一长10 299 nt的开放阅读框。在核苷酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株的全基因组和各基因的同源性均高,而与GⅢ分离株则较低;而在氨基酸水平,HEN0701株与GⅠ分离株在多聚蛋白和各病毒蛋白的同源性和HEN0701株与GⅢ分离株的相近。进化分析显示,不同基因进化树的拓扑结构相近,12株病毒的C、E、NS3、NS5基因进化方向相同,GⅠ分离株和GⅢ分离株间C基因进化距离最近。