新城疫病毒La Sota及F48E9毒株P和V及W蛋白C端功能域的原核表达及其多克隆抗体的制备

以新城疫病毒La Sota、F48E9株为模板,扩增获得P、V、W基因C末端。原核表达后利用Ni柱纯化6种融合蛋白,并制备6种多克隆抗体,ELISA效价测定结果均大于1∶2 560,Western-blot试验结果表明其具有良好的特异性。本研究成功地制备了La Sota、F48E9株P、V、W蛋白的多克隆抗体,为进一步研究新城疫病毒P、V、W蛋白的生物学功能奠定了基础。     

一株洞庭湖候鸟新城疫病毒的分离鉴定及基因组特征分析

为监测湖南省洞庭湖候鸟携带新城疫病毒的现状,本研究于2014年春季在湖南洞庭湖畔采集了150份候鸟粪便样品。经SPF鸡胚分离纯化和RT-PCR鉴定,获得1株新城疫病毒,命名为Swan/Hunan/123/2014(HuN,GenBank登录号:KT894018)。利用RT-PCR方法扩增了HuN株全基因组,并进行基因组序列测定。序列分析表明,HuN株基因组长度为15 186bp,编码的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 GK-Q-G-R-L117,符合新城疫经典弱毒株的分子特征。F基因相似性分析显示,其核苷酸序列与Queensland V4疫苗株、La Sota疫苗株和ZJ1毒株的同源率分别为99.8%、90.4%、81.3%。对HuN株的F基因、HN基因和全基因组遗传进化分析结果均显示,此毒株与Queensland V4株聚为一类,属于副黏病毒血清1型中的ClassⅡ类基因Ⅰ型新城疫病毒。     

表达EGFP蛋白新型重组新城疫病毒疫苗载体的构建

为构建新型新城疫病毒(NDV)载体疫苗,前期我们将La Sota全长c DNA中的F基因编码区替换为基因Ⅶ型NDV的F基因编码区,并将其裂解位点突变为弱毒株的序列,构建获得了p NDFLSP-m F重组质粒。为探索p NDFLSP-m F是否能够作为载体有效地表达外源蛋白,在p NDFLSP-m F的P基因与M基因之间引入PmeⅠ酶切位点,并将EGFP基因编码区克隆至构建好的p NDFLSP-m F载体中,构建含有EGFP基因的重组质粒p NDFLSP-m F-EGFP。将p NDFLSP-m F-EGFP以及辅助质粒p CI-NP-K、p CI-P-K、p CI-LK共转染表达T7 RNA聚合酶的重组痘病毒预感染的BSR-T7/5细胞,拯救获得了重组病毒La Sota-m FEGFP。通过RT-PCR证明,被拯救的重组病毒中含有插入的外源基因EGFP。荧光观察和Western-blot分析结果表明,EGFP蛋白能在重组病毒中稳定表达。生物学特性测定结果显示,La Sota-m F-EGFP具有低毒力毒株特征,MDT为144 h,能够在鸡胚上有效地复制,EID50为1×108.75/0.1 m L。上述研究结果为研制和开发新型NDV载体疫苗奠定了基础。     

赛鸽新城疫病毒南京分离株的生物学特性及其F和HN基因的分析

从南京市某赛鸽公棚发病鸽脑组织中分离到1株鸽新城疫病毒,命名为Pi/NJ/CH/4416/2016(简称ND4416)。各项生物学特性试验结果表明,该分离株为鸽新城疫强毒,对鸽具有高致病性,对鸡的致病性相对较低。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。F基因分析表明,其裂解位点的氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F117,是典型的强毒株共有序列。F、HN基因遗传进化分析发现,本次分离株的基因型为Class II,VIb亚型,且与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与比利时流行株PPMV-1/Belgium/11-09620/2011(JX901124.1)的亲缘关系相近,推测近年国内流行毒株可能来源于比利时。本次分离毒株与弱毒疫苗株La Sota(AF077761.1)的遗传距离较远。生物信息学分析显示,该鸽源分离株HN蛋白第491~500位的一个线性抗原表位发生了改变,血清学试验也显示本毒株与La Sota疫苗株的抗原性差异明显,在一定程度上说明该鸽源毒株已经发生了抗原性变异。     

中国猪瘟兔化弱毒全基因组cDNA文库的构建和序列分析

根据已发表的猪瘟病毒 (CSFV)序列设计并合成了 2 6条覆盖全长基因组的套式和半套式PCR引物。应用RT PCR、NestedPCR和Half nestedPCR技术从试验感染的兔脾中成功地扩增出了各相应的cDNA重叠片段 ,分别克隆和测序 ,构建了C株全基因组cDNA文库。采用DNAstar软件对全基因组的核苷酸和氨基酸序列进行了同源性比较分析。CS FVC株全基因组cDNA文库的构建为进一步构建全长感染性cDNA奠定了基础     

免疫鸽群中2株新城疫病毒的分离鉴定及遗传进化分析

为了研究目前免疫鸽群中新城疫病毒(NDV)感染发病的原因,对2011年从江苏省和湖南省2个免疫过的发病鸽场分离到的2株鸽源NDV进行了生物学特性的测定以及遗传进化分析,并将其与疫苗株La Sota进行交叉中和试验。结果显示,NT-10株为强毒株,HuN株为中等毒力。对其F基因的遗传进化分析表明,二者均为Ⅵb亚型NDV,均为强毒裂解位点,F蛋白上有3个区别于其他基因型的特征性氨基酸位点,即132S,259H,380N。中和试验结果表明,2个NDV分离株与La Sota的抗原性差异很大。结果表明,Ⅵb亚型仍然是鸽群中新城疫病毒的主要流行株,该亚型具有明显的宿主感染特异性;鸽源Ⅵb亚型NDV分离株与La Sota的抗原性差异较大,这可能是免疫鸽群中发生NDV感染的重要原因之一,有必要研制用于预防鸽群中Ⅵb亚型NDV感染的新型疫苗。     

新城疫病毒Mukteswar毒株反向遗传系统的建立

为了建立新城疫病毒(NDV)Mukteswar毒株的反向遗传操作系统,根据已测定的NDV Muk-teswar毒株的全基因组序列设计了5对引物,扩增出包含全基因组cDNA的5条片段,并按一定顺序依次克隆入pSL1180载体中,然后在cDNA 5′末端插入T7启动子序列,3′末端导入具有自我剪切功能的丁肝病毒核酶序列和T7转录终止信号,构建了能转录具有精确5′和3′末端全基因组cDNA的转录载体pNDVT7。将表达核蛋白、磷酸蛋白及转录大蛋白的辅助表达载体pCIneoNP、pCIneoP和pCIneoL与pNDVT7按一定比例混合共转染BRS-T7细胞,4 d后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,结果获得了高效价的重组病毒。表明本研究建立的反向遗传系统能高效、快速拯救重组新城疫病毒毒株。     

蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离株SD1009株感染性克隆的构建与病毒拯救

为探究蛋鸡J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的致病机理,从山东省某鸡场送检的蛋鸡病料中分离鉴定出1株ALV-J,命名为SD1009株,采用PCR方法分3段扩增出SD1009株的前病毒cDNA,PCR产物经克隆酶切后顺次连接,获得1个含有完整ALV-J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009。全长测序及序列比对分析发现,近年来分离的ALV-J都存在缺失部分rTM和DR区的序列,缺失长度为205bp。通过外源基因嵌合的方式,将205bp嵌合进入,又获得了1个前病毒cDNA的重组质粒,命名为pBW-SD1009A205,将pBW-SD1009和pBW-SD1009A205分别转染DF1细胞,通过间接免疫荧光试验,禽白血病抗原试剂盒检测,反转录酶试剂盒检验,表明拯救出了2株病毒,分别命名为rSD1009和rSD1009A205。本研究成功构建了蛋鸡ALV-J的感染性克隆,并在序列分析的基础上,又构建了第2株补全缺失序列的感染性克隆,结果表明缺失部分rTM和DR区的序列,对病毒的拯救以及病毒的复制动力学无显著影响。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。