姜射栀提取物涂膜剂对家兔人工感染真菌皮癣病的疗效观察

为筛选天然抗皮癣病真菌新药,观察了姜黄射干栀子(姜射栀)中药组方涂膜剂对家兔真菌皮癣病的疗效。用犬小孢子菌标准菌株人工感染健康家兔,采取有皮肤症状家兔的皮屑、被毛,进行真菌学分离培养及鉴定以确定真菌菌悬液造模成功的最低浓度。采用最低浓度的菌悬液造模。分别用22.5、67.5、202.5g/L姜射栀提取物涂膜剂通过皮肤涂擦法治疗家兔真菌皮癣病,比较观察涂膜剂的疗效。结果显示,通过培养特性、菌落性状、菌丝形态、孢子性状特征等鉴定,确定造模成功的犬小孢子菌悬液的最低浓度为1×108 CFU/mL;67.5、202.5g/L剂量组涂膜剂对家兔真菌皮癣病均有较好的疗效,其中202.5g/L涂膜剂对家兔人工感染真菌皮癣病有治愈的作用。结果表明,姜射栀提取物涂膜剂对家兔人工感染真菌皮癣病具有一定的疗效,为进一步筛选抗真菌外用新药提供了重要依据。     

油樟叶挥发油对三种真菌的抗菌效果

为探讨油樟叶挥发油对须毛癣菌、犬小孢子菌和石膏小孢子菌的抑制活性及其作用机理,采用RPMI 1640液体培养基倍比稀释和沙氏琼脂平板稀释培养计数法分别检测油樟叶挥发油对这3种真菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC);并绘制体外杀菌曲线,观察MIC浓度下油樟叶挥发油对3种真菌的动态杀菌过程;透射电镜下观察油樟叶挥发油在MIC浓度下对3种真菌超微结构的影响。结果显示,油樟叶挥发油对3种真菌的MIC和MFC值均为3.125μL/mL;杀菌曲线表明,作用的前12h内油樟叶挥发油对3种真菌的杀菌作用最强,随后杀菌作用降低;电镜下对照组的3种真菌形态正常,在MIC浓度下,3种真菌原有的细胞器模糊不清、溶解或消失。试验证实,油樟叶挥发油对3种真菌具有较强的杀菌作用,其杀菌机理为破坏真菌的细胞器。     

家兔皮肤真菌双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测方法的建立

为建立家兔皮肤真菌快速检测方法,根据GenBank相关基因,分别设计皮肤真菌和须癣毛癣菌这2对特异引物,建立了皮肤真菌和须癣毛癣菌双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法。结果显示,在熔解温度86~86.5℃和88.5~89℃分别出现皮肤真菌和须癣毛癣菌特异波峰,且与其他真菌没有交叉反应;重复试验变异系数为0~0.32%;最低检测浓度为3.3×10/mL;分离菌株样本与病料样本双重SYBR GreenⅠ定量PCR检测结果一致。结果表明,本试验建立的双重SYBR GreenⅠ定量PCR方法特异、稳定、敏感,可以用于临床样品的检测。     

家兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立家兔须癣毛癣菌快速检测方法,根据GenBank上已发表的须癣毛癣菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计了1对特异性引物,建立了检测须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床分离的须癣毛癣菌和病料进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对须癣毛癣菌的最低检出量为10copies/μL;特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需2h即可完成整个试验过程。提示该方法可用于须癣毛癣菌的检测。     

兔万博节皮菌的分离鉴定

利用r DNA ITS序列分析,结合真菌形态学对兔的病原菌进行了鉴定。采集疑似患皮肤真菌兔的皮屑、结痂和被毛等病料,在沙保弱培养基分离培养;用分离菌株进行动物回归试验;提取分离菌株DNA,采用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,扩增产物测序后在Gen Bank核酸数据库中进行同源性比对。结果显示,共分离出29株真菌,其菌落为颗粒状、背面有褐色色素沉着;显微镜下小分生孢子为葡萄状,大分生孢子为棒状,菌丝为螺旋状;病理组织切片显示,病变部位皮肤充血、毛囊内有孢子样菌丝段;r DNA序列比对结果显示,分离菌株与须癣毛癣菌复合体的万博节皮菌有98.6%~95.0%的同源性。根据ITS区序列比对结果,结合菌落的形态学特征和兔皮肤病理变化,证明所分离的菌株为万博节皮菌。     

一株鸭源巴氏杆菌强毒株的分离鉴定及致病性研究

为确定导致山东某地区种鸭发病的病原,从病鸭肝、心、肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定为禽多杀性巴氏杆菌。致病性试验结果表明,1.3×109CFU/m的菌液10倍系列稀释后,感染20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭,该分离菌对20日龄健康雏鸡和1日龄健康雏鸭的半数致死量分别为10-4.5CFU/mL、10-5.3CFU/mL;死亡雏鸡(鸭)的剖检病变与发病鸭类似并分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对头孢曲松、氨苄西林、阿莫西林、环丙沙星、卡那霉素等较为敏感。     

家兔须毛癣菌感染模型的构建

为了建立须癣毛癣菌感染家兔模型,对临床分离的须癣毛癣菌进行基因分型,选用Ⅰ型菌制成孢子悬液,直接涂抹剪毛后的家兔皮肤,观察皮肤大体和显微结构病变情况。结果发现,皮肤涂抹孢子悬液后,大体病变皮肤潮红、皮屑增多,有渗出,形成结痂;显微镜下,皮肤充血,角质层增厚,炎性细胞浸润,局部形成脓肿;皮肤组织进行特殊染色,在毛囊或毛干内有大量菌丝;从病变皮屑中分离鉴定出须癣毛癣菌。上述结果提示,本试验成功建立了须毛癣菌感染家兔模型。     

动物皮肤真菌病(皮癣)诊断与预防的研究——疣状毛癣菌的分离与鉴定

1989年兰州地区部分奶牛场发生牛的皮癣病。主要见犊牛感染,其中五泉奶牛场有犊牛28头,发病5头,发病率为18％。段家滩奶牛场有犊牛61头,患皮癣病3头,发病率为62％。采取病料直接镜检时发现大量感染的真菌孢子。将病料接种于SGA、DTM和STIY培养基,分别置于30℃和37℃进行培养,结果分得D_1、D_2、D_3三株真菌。这三株真菌具有相同的形态学特征和生化特性,初步鉴定认为是毛癣菌属的疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)。该菌在室温(18～25℃)或液氮中可较长时间保存。用该菌实验感染家兔2只,结果2/2发病。从而证明所分得的疣状毛癣菌是此次牛发生皮癣病的病原。     

鸡传染性腺胃炎病原的分离鉴定

河北省某个体户蛋用种鸡场连续孵化出的7批海赛商品雏鸡共6万余只,在30～80日龄时发生一种以极度消瘦、腺胃肿大为特征的疾病.采集发病鸡的腺胃进行病原分离鉴定,从中分离出传染性支气管炎病毒(IBV).将发病鸡的腺胃匀浆乳剂及第5代鸡胚分离物接种SPF鸡,结果用鸡腺胃匀浆乳剂接种的鸡出现了与自然病鸡相同的临床症状,而用第5代鸡胚分离物接种的鸡未能复制出腺胃肿大病例.取各接种组鸡血清进行17种相关病原抗体检测,结果接种病鸡腺胃匀浆乳剂的鸡检出了网状内皮组织增生病病毒(REV)抗体.初步试验结果表明,此次发生的以腺胃肿大为特征的疫病可能与REV感染有关,而所分离到的IBV本身并不能引起腺胃肿大.     

地昔尼尔乳剂的制备及其HPLC测定方法的建立

为制备地昔尼尔乳剂并建立其质量浓度的测定方法,以稳定常数和离心稳定性作为乳剂稳定性评价指标,采用单因素试验和正交设计试验法考察处方因素和工艺因素对乳剂稳定性的影响,以筛选出乳剂的最优处方和制备工艺;采用高效液相色谱法(HPLC)测定乳剂的药物质量浓度。结果显示,地昔尼尔乳剂的最优处方为地昔尼尔50g/L、乳化剂70mL/L、油相125mL/L、助乳化剂160mL/L、稳定剂为3.5g/L;地昔尼尔乳剂的制备方法为乳化温度50℃,20 000r/min高速搅拌10min。建立的HPLC色谱条件为色谱柱X Bridge C18(4.6mm×250mm,5μm),流动相乙腈与水(6mL/L三乙胺+2mL/L甲酸)的体积比为10∶90,流速0.8mL/min,柱温30℃,紫外检测波长267nm,进样体积20μL。在10~100μg/mL的质量浓度范围内,峰面积与药物浓度呈良好线性关系(r2=0.999 9,n=7),回归方程为y=148.01x+91.629。精密度试验相对标准偏差均小于2%,在80%、100%和120%3个添加水平时,平均回收率为98.36%,精密度、回收率均符合要求。定量限和检测限分别为10ng/mL和20ng/mL,测得3批地昔尼尔乳剂的平均质量浓度为49.29mg/mL,为标示量的98.57%。结果表明,该处方合理、制备工艺可靠,所建立的高效液相色谱法可用于地昔尼尔乳剂的检测。     

韭菜挥发油成分的气相色谱-质谱分析及抗常见病原菌活性研究

采用水蒸气蒸馏法提取韭菜挥发油,通过体外抑菌试验检测其抑菌活性,确定体外最小抑菌浓度(MIC);并采用气相色谱-质谱(GC-MS)法分离检测韭菜挥发油成分。结果显示,韭菜挥发油具有广谱的抑菌活性,且对不同细菌的MIC不同。在韭菜挥发油中鉴定出17个组分,主要为二丙烯基-双硫醚(39.308%)、甲基-丙烯基-双硫醚(32.763%)、甲基-丙烯基-三硫醚(12.157%)、二丙烯基-三硫醚(7.330%)。结果表明,韭菜挥发油具有研发成新型抗菌药物与食品防腐剂的潜力。     

白鸡屎藤挥发油抗肠炎沙门菌内毒素作用的分析

为了探讨白鸡屎藤挥发油抗肠炎沙门菌内毒素的作用,将420只7日龄三黄鸡随机分成A、B、C、D、E、F组并对A、B、C组鸡按100μg/mL(1mL)预防用药,在12日龄时对A、B、D、E组口服肠炎沙门菌攻毒,攻毒24h后对A、D组按100μg/mL白鸡屎藤挥发油1mL进行滴鼻给药治疗,同时将不同质量浓度的白鸡屎藤挥发油与内毒素混合对另外90只雏鸡进行肌肉注射攻毒,并进行试验鸡与攻毒鸡临床死亡情况统计、病理组织学观察和肝与血液生化指标测定。结果显示,白鸡屎藤挥发油对肠炎沙门菌内毒素具有灭活作用,可缓解血清ALT和AST活性的升高或使其降低(P<0.01或P<0.05),提升肝及血清中SOD的活性(P<0.01或P<0.05),使肝中MDA含量下降和延缓其升高。结果表明,白鸡屎藤挥发油具有抗肠炎沙门菌内毒素的作用,其机理与其保肝作用和抗氧化损伤作用有关。     

印楝油对兔疥螨幼虫的体外杀螨活性

将兔疥螨幼虫置于聚苯乙烯小平皿中,分别加入不同浓度的印楝油液体石蜡溶液,以天然除虫菊酯和阿维菌素为阳性对照,蒸馏水和液体石蜡为阴性对照,观察记录不同时间段的螨虫死亡数,以死亡率、半数致死时间(LT50)和半数致死浓度(LC50)为指标评价了印楝油对兔疥螨幼虫的离体杀螨活性。结果显示,未稀释的印楝油能在25 min内杀死所有幼螨,其杀螨活性显著强于500 g/L的天然除虫菊酯(825 min,P<0.01),而与25 g/L的阿维菌素无显著差异(19 min,P>0.05);500、250和125 mL/L印楝油对兔疥螨幼虫的LT50分别为1、2、5 h;24 h的LC50和LC95分别为2.908和12.018 mL/L。结果证实,印楝油对兔疥螨幼虫具有较好的离体杀螨活性。     

油樟叶乙醇提取物抗炎活性的研究

为探讨油樟叶乙醇提取物的抗炎活性,建立了用二甲苯诱导小鼠耳肿胀、醋酸诱导小鼠毛细血管通透性增加和角叉菜胶诱导大鼠足肿胀的模型,并测定了角叉菜胶所致大鼠足炎性渗出液中前列腺素E2、组胺和5-羟色胺的含量。结果表明,油樟叶乙醇提取物能显著抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀、醋酸诱导的小鼠毛细血管通透性增加和角叉菜胶所致的大鼠足肿胀,且呈剂量依赖性,并能显著降低角叉菜胶所致大鼠足炎性渗出液中前列腺素E2、组胺和5-羟色胺的含量。证实油樟叶乙醇提取物具有较好的抗炎活性。     

1株抗须癣毛癣菌枯草芽孢菌的鉴定

为了探讨抗须癣毛癣菌感染新的治疗途径,从患须癣毛癣菌病兔自然恢复皮肤分离了1株细菌,经16S rDNA基因比对,并结合菌落形态进行了鉴定,通过体内外试验测定其对须癣毛癣菌的拮抗作用。结果显示,分离株能在营养琼脂培养基生长,菌落为皱褶圆形,菌体呈杆状,革兰染色阳性,基因序列分析与GenBank中的枯草芽孢杆菌相似率为99.8%,该分离株被鉴定为枯草芽孢杆菌。抗菌谱分析显示,分离株对须癣毛癣菌能形成抑菌圈,对白色念珠菌、平滑念珠菌、热带念珠菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌没有抑制作用。该分离株与须癣毛癣菌混合培养,能明显抑制须癣毛癣菌生长。在皮肤涂抹试验中,该分离株能逆转由须癣毛癣菌引起的皮肤病变。本试验证实了分离的枯草芽孢杆菌对须癣毛癣菌有明显的拮抗作用。     

藏獒源犬细小病毒的分离鉴定

为弄清犬细小病毒(CPV)在藏獒中的流行情况,将临床上经胶体金试纸检测为阳性的藏獒直肠棉拭子8份处理后接种猫肾传代细胞(F81细胞),分离到6株病毒,对其进行了血凝试验(HA)、半数组织培养物感染剂量(TCID50)的测定,理化性质鉴定,提取分离株DNA并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增其一特异性片段和VP2全序列,并与GenBank上登录的CPV毒株进行比对。结果表明,接毒后第6～13天在F81细胞上出现了明显的细胞病变(CPE),表现为细胞融合、变圆或拉长;所得分离株能使猪红细胞发生凝集反应,血凝效价为27～211;能抗酸(pH3)、热(60℃)、200mL/L乙醚、480mL/L氯仿;从细胞培养物中分别扩增出与特异性片段825bp一致以及与VP2全基因1 755bp一致的条带。将扩增的VP2序列与GenBank上登录的HQ883267.1、FJ222823.1、FJ005214.1等10个国内外CPV分离株的VP2序列进行比对;结果显示,与北京地区一分离株(HQ883267.1)的同源性最高,为99.0%～99.6%。所得分离株为不同毒株,但均为CPV-2a型。     

禽流感H9亚型油乳剂灭活疫苗的改进

用新引进的 6株禽流感病毒 (AIV )H9亚型和现制苗用的AIV H9毒株分别制备AIV H9、AIV H5、NDV二联三价油乳剂灭活疫苗 ,免疫 5日龄和 10日龄雏鸡 ,于免疫当日直至 80日龄鸡出栏期间定期采血 ,用HI法检测相应的AIV H9、AIV H5和NDV抗体。结果表明 ,10日龄免疫鸡的AIV H9抗体效价最高 ,5日龄和 10日龄免疫鸡的AIV H5抗体效价差别不明显 ;用引进的 3号AIV H9毒株制备的联苗对 10日龄雏鸡免疫后 2 0d产生AIV H9保护性抗体 ,一直持续到 80日龄以上 ,期间的抗体平均效价为 6 .72 (lb) ,而现制苗用的AIV H9毒株制备的联苗免疫力较差 ;现制苗用的AIV H5毒株制备的联苗免疫效力仍较好 ;分别接种 0 .2 5、0 .30mL/只联苗的雏鸡AIV H5抗体效价没有明显差别 ,而AIV H9抗体效价以接种 0 .30mL/只剂量的为高 ;不同日龄、不同免疫剂量的试验鸡NDV抗体效价没有明显差异。     

白鸡屎藤挥发油主要成分的定性定量分析

为了探讨白鸡屎藤挥发油的药代动力学特征及其药物残留检测方法,采用化学试剂法对白鸡屎藤挥发油进行定性分析,然后通过柱前衍生高效液相色谱技术对白鸡屎藤挥发油的主要成分进行了定量检测。化学试剂定性方法的研究结果表明,白鸡屎藤挥发油含有酸类、酚类、醛或酮类、醇类、酯或内酯类(包括△α,β-γ内酯环)以及被还原性成分;高效液相色谱技术分析结果表明,白鸡屎藤挥发油含有丁香酚、异丁香酚、左旋α-松油醇、右旋α-松油醇、芳樟醇、水杨酸甲酯、樟脑、龙脑等药理活性成分,以芳樟醇、水杨酸甲酯、龙脑的含量最高,丁香酚、异丁香酚、左旋α-松油醇、右旋α-松油醇、樟脑的含量相对较高。通过白鸡屎藤挥发油柱前衍生化处理,建立的白鸡屎藤挥发油主要成分的高效液相色谱检测方法具有简单、快速的特点,在30min内可完成对白鸡屎藤挥发油主要活性物的分析,适用于白鸡屎藤挥发油的质量控制、药代动力学研究和药物残留检测。     

豆状囊尾蚴外泌体的分离鉴定及其对家兔免疫应答的调节作用

为探究豆状囊尾蚴外泌体对家兔免疫应答的调节作用,以收集的豆状囊尾蚴分泌排泄产物(ESP)为材料,通过差速离心法分离外泌体,经透射电镜和Western-blot分别对其形态和标志分子进行鉴定。分别用外泌体和ESP免疫家兔,ELISA方法检测家兔血清中特异性抗体和血清细胞因子水平,并通过人工攻虫感染评价其免疫保护效果。结果显示,豆状囊尾蚴外泌体直径为30~150 nm,呈圆形或椭圆形,有完整的脂质双分子层膜结构,且含有外泌体标志蛋白CD63。而且,外泌体免疫组血清特异性抗体、IL-10和IL-4的水平显著升高(P<0.05),而IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05)或差异不显著。经剖检发现,豆状囊尾蚴ESP免疫组和外泌体免疫组的减虫率分别为65.17%和24.88%。结果表明,外泌体通过上调宿主抑炎因子的表达,诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答,从而有利于囊尾蚴在宿主体内的存活。     

淫羊藿-蜂胶佐剂对雏鸡和小白鼠腹腔巨噬细胞活性的影响

用淫羊藿蜂胶佐剂０．２ｍＬ和０．４ｍＬ分别对３日龄雏鸡皮下注射,并于２４日龄时以相同剂量重复注射１次,以注射后不同时间检测鸡腹腔巨噬细胞的吞噬活性;对２８日龄小白鼠隔日皮下注射淫羊藿蜂胶佐剂０．２ｍＬ,并以环磷酰胺为对照。试验结果表明,淫羊藿蜂胶佐剂能显著提高雏鸡腹腔巨噬细胞的吞噬活性,其中０．４ｍＬ剂量组明显优于０．２ｍＬ剂量组;对小白鼠腹腔巨噬细胞的细胞毒效应能明显增强,并能拮抗环磷酰胺的免疫抑制作用。