应用高通量测序DNA甲基化差异体液识别研究

目的通过检测和分析DNA甲基化差异的方法识别三种法庭科学犯罪现场常见体液(唾液斑、精液斑、血液斑)细胞来源。方法利用亚硫酸氢盐法对唾液斑、精液斑、血液斑的DNA样品进行甲基化处理,对由文献[1]和实验过程中筛选得到的甲基化位点进行illumina高通量测序,检测三种体液斑中细胞DNA的甲基化程度,并通过BP神经网络分析每一个位点的甲基化程度与细胞来源的关系及全部检测位点的甲基化程度联合与细胞来源的关系。结果运用BP神经网络对35份样品的73个位点的甲基化程度进行训练和预测,可以将唾液、精液、血液三种来源的DNA样本分开,其准确率达到77.3%。其中精细胞在L81528位点中表现为高甲基化,唾液和血液表现为低甲基化,可将精细胞准确鉴别出来。结论本研究建立的高通量测序分析DNA甲基化差异的方法可通过增加检测位点和样品数量进一步提高识别体液细胞来源的准确率。     

ARMS-PCR技术检测法医学体液样本DNA甲基化方案

目的 案件现场遗留的体液等生物检材对案件性质的判定以及犯罪现场的重建具有重要意义。本研究旨在确定ARMS-PCR技术能否用于DNA甲基化位点的检测，评估候选的DNA甲基化标记物是否具有体液特异性，以便于解决目前体液鉴定复杂、成本高、混合样本识别困难等问题。方法 利用ARMS技术设计DNA甲基化特异性引物，构建复合扩增体系，通过毛细管电泳进行分型检测。结果 本研究利用ARMS技术以及毛细管电泳构建了包含22个甲基化位点的复合扩增体系，进一步检测并识别出了100例单一体液样本。结论 该方法可实现甲基化位点的检测，是一种快速、低成本的检测方式，候选位点具有体液特异性。     

SNRPN基因rs220030位点的分型及甲基化亲缘相关性

目的建立变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术与焦磷酸测序技术对小核核糖核蛋白多肽N(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N,SNRPN)基因rs220030位点的分型方法。建立应用焦磷酸测序技术分析CpG甲基化状态的方法,探讨rs220030位点用于亲缘等位基因判定的可行性。方法应用DGGE技术对97例上海地区汉族家系血样rs220030位点进行分型,同时应用焦磷酸测序技术对其中25例血液来源的家系样本的rs220030位点分型,并对两种方法在SNP分型结果上进行比较。通过重亚硫酸盐修饰联合焦磷酸测序技术分析随机2组家系样本rs220030位点上游CpG甲基化状态,判断甲基化是否有亲缘相关性。结果经DGGE检测97例家系血样rs220030位点分型结果为C纯合子20例,T纯合子29例,C/T杂合子48例。经焦磷酸测序检测25例血液来源的家系样本结果与DGGE检测结果一致。经重亚硫酸盐修饰联合焦磷酸测序技术分析,2组血液来源的家系子代的rs220030位点上游CpG甲基化状态均与母亲较相似。结论相比DGGE技术,焦磷酸测序技术更精确、方便,适合大样本、高通量SNP分型。重亚硫酸盐修饰联合焦磷酸测序技术可以精确分析CpG甲基化状态。rs220030位点可用于亲缘等位基因判定。     

利用朴素贝叶斯和多元logistic回归构建月经血mRNA标志分析模型

目的 利用月经血特异性mRNA标志检测技术结合统计学方法,建立基于朴素贝叶斯和多元logistic回归方法的月经血鉴定模型,以定量区分月经血与其他体液。方法 采集86份月经血、48份外周血、48份阴道分泌物、24份精液和24份唾液样本,经试剂盒提取样本RNA、反转录后得到cDNA,对5种月经血特异性标志,包括基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）家族的成员MMP3、MMP7、MMP11,孕激素相关子宫内膜蛋白（progestogensassociatedendometrialprotein,PAEP）和斯钙素-1(stanniocalcin-1,STC1)进行扩增和电泳检测分析。采用朴素贝叶斯和多元logistic回归对检测结果进行分析。结果 朴素贝叶斯和多元logistic回归法构建的分类模型对月经血归类的准确率达88.37%和91.86%。在非月经血体液中,对外周血、唾液和精液的区分准确率普遍高于90%,分辨阴道分泌物时准确率较低,分别为16.67%和33.33%。结论mRNA检测技术结合统计学方法可对月经血建立分类判别模型,可用于区分月经血和其他...     

基于microRNA表达谱初步构建PLS-DA体液识别模型

针对外周血、唾液、精液、月经血、阴道分泌物这五种法医学常见的体液样本，采用二代测序（NGS）平台检测获得microRNA(miRNA)表达谱，使用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）建立基于这五种体液的识别模型，并探讨PLS-DA在法医体液溯源中的应用价值。经优化小分子RNA文库制备过程，采用Ion Torrent S5 XL测序系统对前述法医学五种体液样本（每种10例）进行小RNA测序，以PLS-DA构建体液识别模型，评估不同数量miRNA标记组合下预测的准确性。本研究获得法医学常见五种体液样本的miRNA表达谱，外周血与月经血中表达量前10名的miRNAs有6个重叠；唾液和阴道分泌物中表达量前10名的miRNAs有4个重叠。基于全数据集、107个和11个miRNAs构建的体液来源识别模型的准确率分别为0.95、0.94、0.89。本研究通过NGS测序分析获得了五种体液样本的miRNA组（miRNome），利用PLS-DA初步构建了体液识别模型，对于应用miRNome进行体液识别的相关研究具有参考价值。     

DNA甲基化在组织/体液来源鉴定中的研究进展

对可疑生物样本的组织/体液进行来源鉴别是重建犯罪现场、推断犯罪性质等侦查活动中极为重要的一环。对表观遗传学理论的研究证明运用基因组中存在的组织特异性DNA甲基化差异位点(t DMRs)可以对组织/体液进行来源鉴别。本文旨在通过对近年来DNA甲基化在法医学领域用于鉴定人体组织/体液来源方面的研究成果进行阐述,试图用所得到的信息来分析DNA甲基化作为一种组织/体液鉴定遗传学标记的可能性、优劣点及其应用价值和发展前景,以期能为法医工作者的相关研究及实践提供参考。     

应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP遗传标记

目的 探讨基于SNaPshot技术的精液特异性编码区单核苷酸多态性（codingregionsinglenucleotidepolymorphism,cSNP）遗传标记检测在精液（斑）溯源及混合体液（斑）鉴定中的可行性。方法 制备16例精液斑和11例精液-静脉血混合斑样本,提取其基因组DNA(genomicDNA,gDNA)和总RNA,并将总RNA逆转录为互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。在已验证的精液特异性mRNA编码基因上筛选cSNP遗传标记。基于SNaPshot技术构建cSNP复合检测体系并通过CE对样本进行基因分型。结果 成功构建了包含5个精液特异性cSNP的复合检测体系。在16例精液样本中,除了位于TGM4基因上的cSNP在cDNA的检测结果中出现等位基因丢失外,其余cSNP的gDNA和cDNA分型结果高度一致。检测精液-静脉血混合斑时,检出的cSNP分型结果均与精液提供者的基因型一致,未受到静脉血提供者基因型的干扰。结论应用SNaPshot技术检测精液特异性cSNP的方法可以应用于法医学精液（斑）的基因分型,并为混合体液（斑）中精液来源个体的判定提供...     

基于微生物标记物鉴别唾液、阴道分泌物的多重荧光标记复合扩增检测体系构建

目的 构建基于微生物标记物的荧光复合检测体系，实现对唾液斑迹、阴道分泌物斑迹的区分鉴别。方法经文献检索结合本实验室前期工作，根据特异性和丰度筛选唾液和阴道分泌物微生物标记物；制备唾液斑迹、阴道分泌物斑迹样本，提取总DNA，利用毛细管电泳技术构建基于微生物标记物鉴别唾液、阴道分泌物的多重荧光标记复合扩增检测体系，并使用体液斑迹样本对体系特异性、灵敏度进行检验。结果 本研究筛选出5个唾液微生物标记物（微黄奈瑟氏菌Neisseria subflava、非典型韦荣氏菌Veillonella atypica、唾液链球菌Streptococcus salivarius、口腔链球菌Streptococcus oralis、凯托卟啉单胞菌Porphyromonas catoniae）和3个阴道分泌物微生物标记物（卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus、加氏乳杆菌Lactobacillus gasseri、短双歧杆菌Bifidobacterium breve），利用毛细管电泳技术构建了8重微生物荧光标记复合扩增检测体系，并使用140份样本对体系特异性进行验证；测试结果显示，唾液和阴道分...     

体液法医学鉴定miRNA检测方法的建立与应用

目的建立针对体液特异性miRNA的SYBR Green检测方法,用于体液鉴定,探究法医实践中体液鉴定新方法。方法根据文献选出6条miRNAs为靶点,以合成的标准miRNA作为模板进行体系构建,再对实际样本进行验证,检测6条miRNAs在外周血、月经血、唾液、精液中的相对表达量。结果 miRNAs205在不同体液间表达差异不明显;miRNAs451、miRNAs144可明显的区分血与非血;miRNAs214可鉴定月经血;miRNAs888、miRNAs891在精液中高表达。结论建立的针对miRNAs的SYBR Green检测方法合理有效,可用于法医实践中体液鉴定。     

DNA甲基化水平的法医学个体年龄推断

目的建立一种适用于中国人群的与年龄相关的多重甲基化位点检测体系。方法采用高通量测序技术对33个文献报道的与年龄相关甲基化位点进行筛选,确定了4个在中国人群中甲基化程度与年龄高度相关的甲基化基因位点,建立了OLS多元线性回归模型数据库,可以自动计算得出甲基化程度改变与年龄相关的评估值。结果本检测体系适用于刑事案件现场常见的血斑、唾液斑等生物物证的检验鉴定,灵敏度达100ng,年龄预测准确率平均误差在3.685岁以内。结论本研究建立的多重甲基化检测体系可作为法医学应用中年龄推断的一种可靠、有效的方法,为案件侦破提供更多线索,缩小侦查范围,有助于案件的快速侦破。     

DNA甲基化年龄推断及其在法医学中的应用展望

随着DNA甲基化检测技术的发展,年龄相关甲基化修饰位点的研究发现了更多跨组织的年龄特异性位点,这使得个体年龄推断的灵敏度和准确性都有了提高。此外,各种统计模型的建立,也为不同来源组织的年龄推断提供了新的方向。本文从检测技术、年龄相关胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸位点和模型的选择等方面,对近年来DNA甲基化位点年龄推断的相关研究进行综述。     

mRNA在体液斑迹鉴定与组织来源推断中的应用

体液斑迹鉴定及其组织来源推断一直是法医学研究的重要方向之一,其传统的检验方法存在诸如假阳性率高、检材易破坏等缺陷,亟需更高效的确证实验。高度分化的体细胞表达特异的m RNA分子,可推断其来源:外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌物、接触斑等,且灵敏度、特异度及保存时间相对较为理想,是未来用于体液斑迹鉴别的理想遗传标记。本文对m RNA在体液斑迹鉴定和组织来源推断方面的应用及其前景进行综述。     

DNA甲基化在法医学中的应用前景及其检测方法新进展

DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记。新近的一些研究表明,DNA甲基化在二联体亲权鉴定、同卵双生子法医学个体甄别等案例中可能具有一定的应用前景,可作为STR或SNP等经典遗传标记的有益补充。目前基于甲基化敏感的限制性核酸内切酶、重亚硫酸盐转化以及甲基化CpG结合蛋白等原理已建立了一系列的DNA甲基化检测方法。甲基化敏感的单核苷酸引物延伸、实时荧光PCR、甲基化特异性PCR、甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增、光纤微珠芯片等位点特异性DNA甲基化检测方法都可用于已知CpG位点甲基化状态的检测并可能在法医学实验室具有一定的应用前景;AIMS、HELP、COMPARE-MS等通过对基因组范围内的DNA甲基化扫描分析,可发现具有潜在法医学应用价值的DNA甲基化位点。     

DNA甲基化检测方法及其法医学应用研究进展

DNA甲基化是表观遗传标记的重要组成部分,参与基因表达的调控,在生物发育、衰老以及肿瘤学等领域受到广泛关注。由于具有相对稳定性、可遗传、含量丰富、随龄变化等特点,在法医学领域,DNA甲基化可以作为DNA序列相关经典遗传标记的有效补充,用于年龄推断、组织体液来源检测、同卵双生子的鉴定等。DNA甲基化的检测方法主要有基于甲基化敏感限制性内切酶、重亚硫酸盐转化以及甲基化CpG结合蛋白等原理而建立的一系列方法,近年研究表明,第三代测序技术也可用于DNA甲基化检测。本文就DNA甲基化检测方法及在法医学领域的应用研究进行回顾与综述,以期为法医学实践提供参考。     

法医SNP复合检测体系的构建及应用

目的构建48-SNP位点复合检测体系,用于个体识别、性别鉴定、ABO基因分型。方法采集225份无关个体样本(血斑及口腔拭子),18份案例样本(不同组织及体液斑),选择43个常染色体位点、4个ABO基因位点和1个性别鉴定位点,根据单碱基延伸技术通过GenomeLabTMSNPstream基因分型系统进行SNP分型;并检测体系灵敏度、同一个体不同组织同一性及模拟腐败检材。结果 48-SNP体系分型结果与测序结果的一致性为100%,最小DNA检出量为0.25ng,不同组织来源样本检测同一性很好;利用该体系检测225名无关汉族个体,所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡,整个系统的随机匹配概率为9.4×10-18,累积非父排除率(CEP)为0.999 788,累积个体识别率大于0.999 999 999 999 999 99。结论本文48-SNP体系能同时进行个体识别、ABO基因分型和性别鉴定,可以作为现有STR检验体系的补充。     

circRNA应用于体液斑鉴定的技术可行性研究

目的利用circ RNA检测技术,探索circ RNA分子应用于体液斑迹鉴定的可行性。方法制备精液、唾液、阴道分泌物三种体液斑迹样本,以Qiagen RNeasy Micro试剂盒提取总RNA,经RNase R消化后得到circ RNA,进行逆转录PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测分析。结果制备的体液斑迹样本均可检测到circ RNA分子,提示circ RNA普遍存在于法医常见体液斑迹中,具备一定的应用价值。结论 circ RNA的检测可与现有DNA检测技术兼容,利用其组织特异性,可成为体液斑迹鉴定的新标记,具备重要的研究价值。     

用人血清-唾液-初乳斑痕吸收免疫抗血清制备特异性抗人精液血清

本研究采用人血清-唾液-初乳混合液斑痕吸收抗人精液免疫血清,以消除抗血清的外器官特异性交叉反应。吸收后的抗人精液血清,仅和人精液及附睾和前列腺组织提取液发生反应,和人血清、唾液、初乳、阴道分泌液及尿液等5种人类体液分泌液及22种人体组织浸取液无交叉免疫反应;和8种动物精液也无交叉反应,具有良好的器官及种属特异性。获得的抗血清清亮透明,效价高。血清吸收方法简便易行,成本低,易于普及推广。     

DNA甲基化年龄推断模型在华东汉族人群中的跨平台应用

目的 评估基于DNA甲基化年龄推断模型在华东汉族人群中的法医学应用价值,为探索适用于不同检测平台的年龄推断模型提供理论依据。方法 根据已发表的中国汉族人群血液DNA甲基化年龄推断模型中6个年龄相关甲基化位点,使用焦磷酸测序和下一代测序（next-generationsequencing,NGS）技术分别检测48例样本的DNA甲基化水平,分别将其代入年龄推断模型后计算预测年龄,并与真实年龄进行比较。结果 两种检测技术下6个甲基化位点都与年龄相关,使用焦磷酸技术的R2为0.85,平均绝对误差（medianabsolutedeviation,MAD）为4.81岁,使用NGS技术的R2为0.84,MAD=4.41岁。结论 该血液DNA甲基化年龄推断模型可以在焦磷酸测序与基于NGS的多重目的区域甲基化富集测序技术下使用,并能够较为准确地推断年龄。     

用特异兔抗人精蛋白抗体间接ELISA法检测人精斑

本文报告利用抗人精血清进一步精制而得的特异兔抗人精蛋白抗体进行间接ELISA试验检测人精斑的方法。经用61例各种常见体液斑检材及多人不同浓度的精液、唾液、乳汁、血液等体液稀释液进行测试,结果正确检出精斑的准确率达100％。对混合多人精液稀释液的最高检出稀释度为1/10000,非精斑检材均不出现阳性反应。该法的特异性完全适合精斑确证检验鉴定的需要,其灵敏度明显高于传统的精斑确证检验方法。本法操作简单,无需特殊仪器设备,使用的抗体来源方便,便于应用。