切创后细胞自噬及炎症因子的表达与损伤时间的关系

目的观察小鼠皮肤切创后不同时间细胞自噬与炎症细胞因子的变化,同时探讨这些变化与损伤时间之间的关系。方法采用RT-PCR及West-blot方法检测小鼠皮肤切创组织在不同时间Beclin-1、LC-3、IL-1α、IL-1β、MCP-1的基因表达及蛋白表达。结果皮肤切创后早期IL-1α、IL-1β基因的表达及蛋白表达水平有所升高,12小时达到最高值,而后呈下降的趋势;MCP-1的表达在损伤后6h开始升高,48h达到最高值,72h有所下降,而Beclin-1、LC3基因及蛋白表达在组织损伤后6h开始升高,24h到达到最高值而后下降。结论小鼠皮肤组织切创后细胞自噬的启动及自噬的最高值明显晚于炎性细胞因子的启动及炎症因子表达的最高值,实验发现当细胞自噬水平达到最高时,炎症因子的水平则开始表现为下降的趋势。这可能是随着切创组织中炎症因子释放的增多激活了细胞的自噬,而当自噬水平达到一定的程度又抑制过度的炎症反应。自噬与炎症因子的表达随着小鼠皮肤创面损伤后不同时间呈现出一定的变化规律,这为组织损伤后损伤的时间推断提供一定的参考。     

大鼠生前与死后损伤肌肉组织中自噬相关蛋白表达

目的研究大鼠骨骼肌损伤后BECN1、LC3和p62三种自噬相关蛋白的表达,探讨其在鉴别生前与死后损伤中的应用。方法 72只健康成年Sprague-Dawley大鼠被随机分为未损伤的对照组、生前损伤组(0.5、1、2、4、8、16和24 h)和死后损伤组(0.5、1、2和4 h),制作大鼠右后肢损伤模型。运用Western印迹法检测对照组、生前损伤组以及死后损伤组骨骼肌中自噬蛋白BECN1、LC3-2/LC3-1和p62的表达,分别将数据中心化和标准化处理,建立生前损伤和死后损伤正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least square-discriminate analysis,OPLS-DA)鉴别模型。结果大鼠骨骼肌挫伤后BECN1、p62蛋白的表达以及LC3-2/LC3-1值在生前损伤和死后损伤组中虽有不同程度的变化,但差异无统计学意义。BECN1的表达量及LC3-2/LC3-1值经中心化和标准化处理后,可区分生前损伤和死后损伤。生前损伤和死后损伤OPLSDA模型提取的主成分对模型的解释程度较好(Rx2=0.563,Ry2=0.439),但预测程度稍差(Q2=0.366)。结论大鼠骨骼肌损伤局部组织中BECN1、LC3-2/LC3-1值可用于生前损伤和死后损伤的鉴别。     

腹腔连续注射低剂量氯胺酮后大鼠海马LC3和Beclin1的表达

目的研究腹腔连续注射低剂量氯胺酮后大鼠海马自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达及其意义。方法 SD大鼠30只随机分为用药组和对照组,用药组大鼠以5mg/kg的剂量腹腔注射氯胺酮,每间隔30min 1次,共5次。对照组予以等量生理盐水。用药组大鼠按用药后时间不同分为6小组,分别于末次给药后1,3,6,12,24,48h后取海马组织备用,用免疫荧光技术和Western blot技术检测大鼠海马组织中LC3、Beclin1的表达,应用统计学处理,比较用药组与对照组的蛋白表达差异。结果与对照组比较,用药组大鼠海马组织中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值在1h表达开始增多,6h呈强表达,Beclinl的表达在6h开始增多,12,24,48h都呈强表达(P<0.05)。结论腹腔连续注射低剂量氯胺酮能促进海马组织发生自噬,自噬增强是对氯胺酮毒性的反应。     

Intermedin在大鼠急性心肌缺血再灌注损伤中的作用

目的探讨Intermedin（IMD）对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的作用。方法72只健康雄性sD大鼠随机分为3组：对照组;缺血再灌注组（缺血1h再灌30min）;IMD预处理组（缺血再灌注前30min静脉注射10^-7mol／LIMD）。检测血清中LDH、心肌中MDA和SOD活性;半定量实时荧光PCR法检测心肌降钙素受体样受体（ealcitonin receptor like receptor,CRLR）、受体活性修饰蛋白（receptor activity modiying protein,RAMP）1／2／3的mRNA表达水平;酶联免疫吸附法（ELISA）测定心肌cAMP含量,SABC法检测Bcl-2／Bax蛋白表达及比值。结果与对照组比较,缺血再灌注组大鼠LDH、MDA分别升高87％和189％,SOD活性下降84％,IMD预处理组LDH、MDA均降低41％,SOD活性升高38％（均P〈0．01）;实验组心肌CRLR、RAMPl／2／3的mRNA水平均明显上调（P〈0．05或P〈0．01）,与对照组心肌cAMP相比,缺血再灌注组和IMD预处理组分别升高1．36、2．90倍（P〈0．05）。Bcl-2／Bax表达比值,缺血再灌注组较对照组降低,IMD预处理组亦低于对照组但高于缺血再灌注组2．225倍。结论IMD对大鼠急性缺血再灌注损伤的心肌有一定保护作用,减少缺血再灌所致的氧化应激,抑制心肌细胞凋亡可能是其作用机制之一。     

大鼠皮肤挫伤后Beclin1和LC3的表达

目的 研究大鼠皮肤损伤后Beclin1、LC3的表达,观察皮肤损伤中的自噬现象,并探讨其在损伤诊断及损伤经历时间推断的意义.方法 运用免疫组化及图像分析技术研究大鼠皮肤挫伤后、损伤不同时间段后Beclin1、LC3表达的变化.结果 大鼠正常皮肤表皮细胞Beclin1、LC3低表达,大鼠皮肤挫伤6h后局部表皮细胞Beclin1、LC3表达开始增多,挫伤3、5和7d呈强表达.结论 皮肤损伤后局部细胞Beclin1、LC3表达增多;其表达与损伤经历时间具有相关性;细胞自噬增强是对损伤的反应.     

Bcl-2蛋白在外伤性癫痫病灶中的表达

目的观察Bcl-2蛋白在外伤性癫痫病灶中的表达变化,探讨其作用机制。方法收集外伤性癫痫、非外性癫痫患者及交通事故死亡者脑皮质各15例,采用免疫组织化学和荧光免疫组织化学技术,观察各实验组Bcl-2蛋白表达水平,测定阳性表达的灰度值,数据采用SPSS 12.0软件进行统计分析。结果外伤性及非外伤性癫痫组Bcl-2蛋白表达水平均高于交通事故死亡组（P〈0.05）;而非外伤性癫痫组表达明显高于外伤性癫痫组,差异亦具有显著统计学意义（P〈0.05）。结论 Bcl-2蛋白能抑制神经元凋亡,对外伤性癫痫的发病过程具有抑制作用。     

慢性乙醇中毒小鼠脑神经细胞IP3R1表达的变化

目的研究慢性乙醇中毒引起小鼠脑神经细胞Ⅰ型1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R1）表达的变化。方法 40只小鼠随机分为90d、180d组,各组再分为正常对照组、10%、20%、30%乙醇组,每组5只,乙醇组给予相应浓度乙醇饮用至相应时间;取各组小鼠脑组织,分别采用免疫组化和Western blot方法检测脑皮质神经细胞IP3R1表达的变化;SPSS 13.0软件对实验数据进行单因素方差分析。结果正常IP3R1免疫组化染色物分布于神经细胞胞浆内。90d组随乙醇浓度的增加,IP3R1免疫组化阳性细胞数和阳性细胞率逐步增加,组间比较,差异显著（P〈0.05）;180d组中10%、20%乙醇组阳性细胞数和阳性细胞率逐步增加,组间比较,差异显著（P〈0.05）,而30%乙醇组阳性细胞数和阳性细胞率反而减少,且低于90d组的相同浓度组（P〈0.05）。Western blot与免疫组化检测结果基本一致。结论慢性乙醇中毒可引起小鼠大脑皮质神经细胞IP3R1表达增加,而高浓度（30%）、长时间（180d）乙醇使IP3R1表达降低,可能与神经细胞变性、坏死、数目减少有关。     

闭锁小带蛋白-1在脑外伤后皮质中的表达变化

目的观察闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)在脑外伤后皮质中不同时段的表达变化。方法建立小鼠脑外伤模型,分为脑外伤后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d组,同时设立假手术组及正常对照组。脑皮质中伊文思蓝(Evans blue,EB)含量检测评估血脑屏障通透性,Western印迹法和免疫组织化学染色法检测损伤皮质区ZO-1的表达。结果脑外伤后1h皮质中EB含量开始增加,伤后1~3d达高峰,伤后7d接近正常。Western印迹法显示,ZO-1在损伤1h后表达下调,损伤1~3d达到最低值,损伤7d后明显回升,但仍低于假手术组和正常对照组。免疫组织化学染色显示,正常脑皮质血管中ZO-1呈强阳性表达,损伤后表达逐渐减弱,损伤3d后阳性表达几乎消失,之后逐渐恢复。结论ZO-1在脑外伤后皮质区呈先降低后升高的表达规律,与脑外伤后血脑屏障通透性变化规律呈负相关,为推断脑外伤损伤时间提供了新指标。     

大鼠皮质神经细胞缺氧缺糖损伤后MAP-2表达变化规律

目的观察原代培养大鼠大脑皮质神经细胞缺氧缺糖（OGD）损伤24h内的形态学及微管相关蛋白2（MAP-2）表达变化。方法使用出生1-2d的Wistar大鼠,取大脑皮质神经细胞进行原代培养,用连二亚硫酸钠加低糖培养基制作神经细胞OGD损伤模型,损伤后应用倒置显微镜观察形态学变化,Western印迹法观察MAP-2蛋白表达变化。结果原代培养大鼠大脑皮质神经细胞OGD损伤后1h,少数神经细胞突起缩短;伤后6-12h神经细胞胞体明显皱缩,多数细胞突起缩短或消失;伤后24h神经细胞形态部分恢复,部分突起重新出现。Western印迹法显示,MAP-2在神经细胞OGD损伤后1h表达降低,伤后12h达低谷,24h表达升高。结论 OGD损伤后,原代培养大鼠大脑皮质神经细胞的形态及MAP-2表达随时间呈现一定的规律性变化。     

大鼠毒鼠强中毒内脏器官Caspase-3与Bcl-2蛋白的表达

目的探讨大鼠毒鼠强中毒的病理机制。方法SD大鼠60只,随机分正常对照组、空白对照组、高剂量中毒死亡组、低剂量中毒组,高剂量中毒死亡组以1.0mg/kg毒鼠强悬浊液灌胃,低剂量中毒组以0.1mg/kg体重毒鼠强悬浊液灌胃。用免疫组织化学技术对中毒大鼠器官检测caspase-3与Bcl-2蛋白的表达,用图像分析技术对检测结果进行分析。结果各器官caspase-3与Bcl-2蛋白的表达变化规律基本相似,即高剂量中毒组大鼠caspase-3与Bcl-2蛋白均呈较强的阳性表达,低剂量中毒组大鼠,Bcl-2与caspase-3于中毒30min后表达不明显,3h时,可见较为明显的阳性信号,Bcl-2在6h～3d达高峰,随后表达下降;caspase-3在24h～5d达峰值,随后下降。Bcl-2峰值早于caspase-3出现。结论Bcl-2与caspase-3参与了毒鼠强中毒的病理生理过程。     

The study on expression of NF-kappaB in experimental brain contusion in rats

OBJECTIVE: To investigate the expression of NF-kappaB in different post-traumatic intervals and severity of brain injury. METHODS: Fifty-four brain tissue samples of slight (n=24), moderate (n=24) brain injury, sham (n=3) and control (n=3) of rat were examined by immunohistochemical staining, westernblot and RT-PCR. RESULTS: Up-regulating of NF-kappaB expression was found in tissues from traumatic brain injury compared with controls in early 1 hour after TBI, and reached peak at 24h and 48h and disappeared after 7 days. The expression of NF-kappaB mRNA has association with contusion severity. CONCLUSION: NF-kappaB may benefit to the estimation of posttraumatic intervals of brain injury.     

大鼠急性心肌缺血再灌注Bcl-2蛋白的表达及其法医病理学意义

目的为心肌缺血/再灌注损伤所致心性猝死的法医学诊断提供形态学依据。方法运用免疫组织化学方法,研究Bcl-2蛋白在心肌组织中不同区域的表达。结果对照组正常心肌组织无Bcl-2蛋白表达。Bcl-2蛋白再灌注0.5h后即可在缺血区域表达,且表达主要在心肌内层。再灌注1h后可观察到Bcl-2蛋白不仅表达于心肌内层且已经扩展至心肌的全层。再灌注2h发现心肌外层表达明显强于心肌内层,随着再灌注时间的延长可以发现Bcl-2蛋白的表达逐渐减弱。结论在急性心肌缺血再灌注中,Bcl-2基因对心肌细胞凋亡的发生有着重要的作用,且可以作为心肌缺血再灌注的早期诊断提供一项辅助诊断依据。     

大鼠实验性脑挫伤后不同时间脑apoE的表达

目的观察大鼠实验性脑挫伤后脑内apoE蛋白变化的时空性规律。方法采用自由落体撞击法致大鼠脑挫伤模型,观察伤后不同时间(0.5h、2h、6h、12h、24h、3d、7d、14d)apoE蛋白的变化,并用计算机图像分析技术作定量统计分析。结果伤后0.5h组脑皮质神经元apoE出现阳性表达,3d达到高峰,随后下降;伤后0.5h组在海马出现apoE强阳性反应,CA1区在伤后3d达到高峰,而CA2~CA4区在24h达到高峰,随后逐渐下降,伤后海马apoE表达以CA1区最强。结论挫伤后apoE时空性变化规律可作为脑损伤时间推断、早期诊断及生前伤和死后伤鉴别的一个新的参考指标。     

实验性脑挫伤后caspase-3表达的免疫组织化学研究

目的 观察大鼠在不同程度及不同时间脑挫伤后caspase-3表达的变化。方法 对48例实验性脑挫伤大鼠的脑组织进行检验,同时以10例非脑挫伤的脑组织做对照。结果 伤后1h,caspase-3即有表达;24～48h达高峰,2周时仍有阳性细胞存在。阳性细胞多集中于挫伤区及周围带皮质和脑实质内海马区;不同程度脑挫伤组之间于伤后1h,12h,24h,72h,1周和2周caspase-3表达有差异。结论 不同程度脑损伤后caspase-3表达量不同;在脑损伤后caspase-3的表达有时间变化规律,对探讨脑挫伤后二次损害原因和研究脑挫伤程度有一定意义。     

Chemical Analysis in the Corpus Callosum Following Traumatic Axonal Injury using Fourier Transform Infrared Microspectroscopy: A Pilot Study

Evaluating traumatic axonal injury remains challenging in clinical and forensic sciences as its identification is difficult using routine diagnostic methods. This study used Fourier transform infrared microspectroscopy to detect TAI within the corpus callosum in an animal model. Protein conformational analysis revealed significantly increased β-sheet and β-turn contents paralleled by a decrease in α-helix content at 24 h postinjury, while the antiparallel β-sheet content was decreased at 12 h postinjury. Compared with the control group, the lipid/protein ratio was significantly reduced in all of the injured groups. At 24 h postinjury, there were increases in the olefinic=CH and CH₃ group of lipids accompanied by the decreased CH₂ group, but the results at 12 and 72 h were contrary to that at 24 h. Our study showed that FTIRM could differentiate injured from normal white matter at different time points following TBI via examination of these infrared spectral parameters.     

Could NF-kappaB and caspase-3 be markers for estimation of post-interval of human traumatic brain injury?

BACKGROUND: Previous studies in a rat model showed expressions of caspase-3 (p20) and NF-kappaB (p65) in different time after TBI. We test the activation changes of caspase-3 and NF-kappaB of human specimen after traumatic brain injury (TBI) in this study to see whether they could be markers to estimate post-intervals of TBI for forensic practice. MATERIAL AND METHODS: Caspase-3 (p20) and NF-kappaB (p65) immunohistochemical staining were performed on 39 TBI specimens (dead from TBI) and eight controls (dead from none TBI reasons) grouped 0, 12, 24, 48, 72, 168, 264 and 480 h. Positive cells were counted and image analysis techniques were used to determine the morphological changes in each group. RESULTS: Immunohistochemical analysis showed a marked induction of caspase-3 (p20) in every injured group compared with normal controls; each positive group has it's morphological character with variant positive cell count. NF-kappaB (p65) did not showed markedly change compared with normal controls until 168 h after TBI and almost all nerve cells were stained by NF-kappaB (p65) in 264 and 480 h groups. CONCLUSION: NF-kappaB (p65) could contribute to estimate delayed death cases after TBI for forensic applications. Caspase-3 (p20) estimating post-TBI intervals are dubious but could suggest TBI exists.     

人脑挫伤后HSP70和iNOS表达研究

目的探讨人脑挫伤后不同时间内HSP70和iNOS表达的变化关系。方法应用免疫组织化学染色观察35例人脑挫伤组织HSP70和iNOS表达的变化规律。结果HSP70阳性细胞在即刻死亡组表达强度最大,伤后急剧下降,至24h达最低,以后逐渐恢复。iNOS阳性细胞表达强度在伤后48h升高至最大,以后逐渐下降,在伤后11d仍有弱表达。结论HSP70和iNOS免疫组化染色可以作为推断人脑挫伤经过时间的有效指标。