猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪腺病毒3型SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对猪腺病毒3型(PADV3)的检测方法,根据PADV3E1B基因保守序列设计1对引物,建立了检测PADV3的SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR。结果显示,该方法不能对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、猪链球菌2型检测到荧光信号,特异性好;检测PADV3时在3.7×102~3.7×109 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,熔解温度为90.5℃;该方法组内变异系数为0.17%~1.23%,组间变异系数为0.73%~2.23%,重复性较好。应用该方法对临床56份腹泻粪便检测,检出11份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。上述结果表明,建立的实时荧光定量PCR为PADV3感染的早期诊断、流行病学调查奠定了技术基础。     

猪博卡病毒5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪博卡病毒5型NS1基因序列设计引物,建立了基于SYBR GreenⅠ的用以检测猪博卡病毒5型的实时荧光定量PCR。用该方法检测猪博卡病毒5型NS1基因,在3.64×102~3.64×107 copies/μL范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为(83.12±0.12)℃,对猪圆环病毒(PCV1和PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪输血传播病毒(TTV1和TTV2)的核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.35%~1.24%,组间变异系数为0.43%~1.46%。此方法的建立为定量分析猪博卡病毒5型感染猪的感染程度和靶器官提供了精确检测手段。     

猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR诊断方法的建立及初步应用

自2014年美国首次报道猪Delta冠状病毒(PDCoV)以来,该病毒相继在我国一些猪场检测到,由于其发病症状和病理剖检与猪流行性腹泻(PED)极其相似,且易出现混合感染,临床很难区分,给养殖业造成严重经济损失,因此建立能够同时检测且能区分这两种病毒感染的诊断方法,对于临床实践具有重要意义。根据GenBank中登录的PDCoV和猪流行性腹泻病毒(PEDV)基因序列,设计了2对分别用于扩增PDCoV N基因和PEDV M基因的目的片段的引物,通过对RT-PCR反应条件进行优化,建立了同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR检测方法,并对该方法进行了灵敏性、特异性和重复性研究。结果显示,该双重RT-PCR对PD-CoV和PEDV的最低检测量分别是3.14×10~3 copies/μL和3.88×10~4 copies/μL。该方法仅对PDCoV和PEDV检测为阳性,对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、博卡病毒(PBoV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病毒(PRV)等猪常见的感染病毒的扩增均为阴性,说明该方法具有较好的特异性。用建立的双重RT-PCR方法对111份临床样品进行检测,其中PDCoV阳性样品22份,阳性率为19.82%,PEDV阳性样品27份,阳性率为24.32%,PDCoV和PEDV共感染的样品数为10份,阳性率为9.01%。本试验所建立的双重RT-PCR方法能够快速、准确地对PDCoV和PEDV单一或混合感染的临床样品进行快速检测,为临床上对PDCoV和PEDV鉴别诊断和流行病学调查研究提供了新的技术手段。     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立

采用PCR方法从猪圆环病毒2型(PCV2)山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)和大肠杆菌(Escherichia coli)的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。     

三种猪腹泻病毒性病原多重RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪A群轮状病毒(GAR)的基因序列保守区,分别设计了3对引物。通过对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了检测PEDV、TGEV和GAR的三重RT-PCR方法,并对其灵敏度、特异性进行了检测。该方法的最低检测量分别为PEDV 0.24pg、TGEV 2.3pg、GAR 1.5pg;特异性试验显示,它对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪萨佩罗病毒、猪博卡病毒、猪环曲病毒、猪源大肠杆菌、猪链球菌2型、猪源沙门菌、空肠弯曲杆菌和金黄色葡萄球菌等均不产生非特异性扩增。利用该方法对采自四川省6个猪场的46份样品进行检测,结果,PEDV阳性率达76.1%,TGEV阳性率为19.6%,而GAR未被检出;表明同场样品中存在PEDV与TGEV的混合感染。同时用文献报道的单一RT-PCR法对上述样品进行检测,结果符合率均为100%。结果表明,建立的三重RT-PCR具有较高的灵敏度和特异性,可用于PEDV、TGEV和GAR的检测。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-7ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-10ng/μL,敏感性提高了1 000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

PCV2型和PCV3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速、特异地鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,本研究根据PCV2和PCV3保守区域基因序列,采用Primer Express 6设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针。经过引物筛选和条件优化,建立可鉴别检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR方法。本方法能同时特异性地检测鉴别PCV2和PCV3,且与CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA病毒核酸没有交叉反应。本方法灵敏性强,PCV2和PCV3的最小检出量分别为48.1 copies/μL和58.3 copies/μL。组间和组内试验变异系数不超过1.5％,重复性好。结果表明,本研究创建了一种灵敏度高、特异性强的PCV2和PCV3双重荧光定量PCR方法。     

一种新型同时检测6种猪病毒病简化靶序列富集多重PCR的建立和初步应用

为建立一种新型同时检测6种猪常见病的方法,针对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的保守基因,设计6对特异引物,在引物的5′端加上一段非同源性标签序列,再设计1对可识别标签序列的超级引物。通过优化反应条件,建立了6种猪常见病毒的简化靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)检测方法。灵敏度试验结果显示,该方法对PRV、JEV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV核酸的最低检测限度分别为4.36×103、2.21×103、2.69×103、3.18×103、2.63×104、3.12×104copies/L,而单重PCR检测的最低限度分别为1.3×101、2.59×102、8.03×101、3.29×101、2.65×101、2.45×102copies/L。该方法对54份临床样本的检测结果与国标单重PCR检测结果的一致性为94.9%。本试验建立的方法特异、灵敏、操作简便且成本低廉,对这6种猪病常见病原的同时检测有一定的参考意义。     

猪细环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

参考猪细环病毒1型(TTSuV 1)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV 1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测TTSuV 1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法标准曲线的决定系数为0.999 5,表明具有优良的线性关系;最低可精确检测63copies/μL的核酸模板;重复性试验的变异系数小于2%;对TTSuV 2、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等均检测不到荧光信号。对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV 1的检测与定量分析。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型双重荧光PCR检测方法的建立

为建立快速简便检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本研究根据GenBank中已登录的PRRSVORF7基因序列和PCV2 ORF1基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PRRSV和PCV2的双重荧光PCR方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PRRSV和PCV2的灵敏度分别可达1.05 TCID_(50)/100L和6.30 TCID_(50)/100μL,表明,本试验建立的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PRRSV和PCV2进行快速诊断,适合现场检测,为这两种疫病的诊断和防控奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒(ASFV)实时荧光PCR检测方法,本研究根据ASFV CD2v基因序列,设计了TaqMan荧光PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针的比例,建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明,本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性,以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为0.988,斜率为-3.025 4,最低检测限可达到10 copies/μL,且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好,批内和批间变异系数均小于2%。综上,本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。     

猪传染性胃肠炎病毒半巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种高效、敏感、特异的用于检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的半巢式RT-PCR方法,本研究依据GenBank发表TGEV的N基因序列设计3条特异性引物,通过优化反应体系,建立了检测TGEV的半巢式RT-PCR方法,并对反应体系特异性和敏感性进行了检测。结果显示,该方法能够成功扩增483 bp和338 bp两条目的条带;对TGEV具有良好的特异性,与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒均无交叉反应;最低可检测到1.86×10~(-1)pg/μL的TGEV cDNA。用所建半巢式RT-PCR对临床50份猪腹泻样品进行检测,结果显示,阳性率为36%,高于普通RT-PCR阳性检出率,且阳性样品符合率为100%。本试验所建立的半巢式RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可准确地对TGEV感染做出诊断,为TGEV的临床检测、流行病学调查提供了有效手段。     

非洲猪瘟病毒CD2v基因实时荧光PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒（ASFV）实时荧光PCR检测方法，本研究根据ASFV CD2v基因序列，设计了TaqMan荧光PCR引物及探针，通过优化退火温度、引物及探针的比例，建立了ASFV的TaqMan实时荧光PCR检测方法。结果表明，本研究所建立的荧光PCR方法具有良好的特异性和敏感性，以重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系，相关系数为0.988，斜率为 －3.025 4，最低检测限可达到10 copies/μL，且与伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种猪病病毒不存在交叉反应。该方法重复性良好，批内和批间变异系数均小于2%。综上，本研究建立的非洲猪瘟CD2v基因实时荧光定量PCR方法为ASFV的检测提供了一种新的敏感、特异的分子检测技术。