两株不同来源的猪圆环病毒1型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒1型(PCV1)ORF2基因序列,设计了1对引物,应用PCR方法从PK-15细胞和疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的仔猪组织病料中分别扩增出了PCV1 ORF2全基因(702bp)。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体,筛选获得了重组质粒pMD-PCV1-ORF2,并对其进行了测序与分析。结果表明:所克隆的PK-15来源和组织病料来源的ORF2基因的同源性为99.4%,二者与GenBank中登录的PCV1 ORF2基因的同源性为97.3%~99.9%,与PCV2 ORF2基因的同源性为67.9%~68.4%,二者编码的蛋白在几个功能区比较保守。抗原表位预测表明,PCV1 ORF2编码的蛋白具有良好的免疫原性。     

含CpG基序系列猪圆环病毒核酸疫苗的构建

人工合成了系列含有1～24个长度不等、序列不同的CpG-ODN基序,经MluⅠ单酶切、连接后插入到已构建好的真核表达载体pVAX1-ORF2的骨架结构中。酶切及测序结果证实,所构建的系列载体正确,表明已经成功构建了系列含有CpG-ODN的表达ORF2编码蛋白的重组质粒pVAX1-ORF2-CpG,为进一步优化和筛选最佳猪圆环病毒核酸疫苗奠定了基础。     

口疮病毒ORF020基因的原核表达与纯化

根据Gen Bank中口疮病毒ORF020基因序列,利用DNAMAN软件设计引物,以口疮病毒基因组为模板,采用PCR扩增出552bp的目的基因片段。凝胶回收纯化目的片段,将其连接入p MD20-T载体,转化E.coli DH5α并测序。测序正确后再其再连接入p ET-28a(+)表达载体,构建重组质粒p ET28a(+)-ORF020,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的目的蛋白,镍亲和层析纯化目的蛋白。结果表明,成功构建了原核表达载体p ET28a(+)-ORF020,并在E.coli BL21中表达了ORF020基因,诱导得到的融合蛋白与目的蛋白大小一致,证明目的基因被成功表达并得到纯化蛋白。上述研究结果为开展ORF020的功能研究奠定了一定基础。     

猪圆环病毒2型ORF2与EGFP融合蛋白表达载体的构建及在鸭心肌细胞中的表达

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在异源细胞上的表达及生物学特性,构建了PCV2ORF2与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP-N1-ORF2。采用脂质体法转染体外培养的鸭心肌细胞后,通过直接荧光观察EGFP-ORF2融合蛋白在鸭心肌细胞中的分布定位,经RT-PCR、间接免疫荧光方法检测ORF2基因在鸭心肌细胞中的表达。结果显示,转染48 h后有绿色荧光出现,RT-PCR和间接免疫荧光法检测均为阳性。证实,PCV2 ORF2基因在鸭心肌细胞内获得了成功表达。     

山羊痘病毒ORF014蛋白的结构预测及其真核表达

以山羊痘病毒古浪株基因组DNA为模板,经PCR扩增,获得山羊痘病毒ORF014基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(-)B,通过脂质体法将重组质粒转入Vero细胞,Western-blot分析目的基因表达情况。使用WabLab、SWISS-MODEL和ExPASY等在线软件预测GTPV014蛋白的功能结构域和二、三级结构以及氨基酸组成,对其作为凋亡抑制蛋白的真实性、可靠性做出理论上的判断。结果显示,重组表达载体可以在Vero细胞中表达出大小约为20ku的重组融合蛋白,该蛋白具有与黏液瘤病毒M11L蛋白相似的一些结构特征。上述结果为GTPV014蛋白在山羊痘病毒感染过程中抑制凋亡的研究提供了一些理论依据。     

三黄鸡IFITM3基因的克隆及其真核表达载体的构建

为研究禽类干扰素诱导跨膜转运蛋白(interferon-induced transmembrane proteins,IFITMs)基因抗流感病毒的功能和分子机制,用PCR扩增了三黄鸡IFITM3基因并进行序列测定及其编码蛋白的结构分析。在此基础上,构建了pIRES2-EGFP-IFITM3真核表达载体并转染至DF-1细胞。分析结果显示,该基因随物种发育进化地位的不同而表现出种属间差异性,编码蛋白由113个氨基酸构成,存在2个潜在跨膜区,不含信号肽。转染结果显示,pIRES2-EGFP-IFITM3真核表达载体在DF-1细胞中成功表达。研究结果为构建IFITM3专性表达细胞系及三黄鸡IFITM3蛋白抗病毒分子机制的研究奠定了基础。     

PRRS病毒M蛋白在大肠埃希氏菌中的高效表达

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF6基因从pGEM-T-ORF6重组质粒中亚克隆到pET-5a原核表达载体上,成功构建重组表达质粒pET5-ORF6.将其转化大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态细胞,重组菌经IPTG诱导表达,其细菌裂解物经SDS-PAGE可检测到分子质量约为19 ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的26.8%,采用重组菌裂解物作为包被抗原进行ELISA检测,结果表明表达的蛋白显示特异性.     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒(PCV-2)的核酸序列,设计了1对引物,采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因,将其克隆到pMD18-T载体上,筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析,结果表明,克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92.0%~93.3%,推导氨基酸序列的同源性为82.9%~84.6%。重组质粒pMD18-T-ORF2经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切,将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES,成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

山羊前动力蛋白2基因的克隆及其在OFTu细胞中的表达

为深入研究前动力蛋白2(prokineticin 2,PK2)在山羊炎症性疾病中的作用,本研究克隆了海南黑山羊的PK2基因,并对其基因序列及编码蛋白进行了分析;构建了过表达载体pEGFP-N1-PK2和干扰表达载体pSUPER-PK2,并转染至羊胚胎鼻甲细胞(ovine fetal turbinate,OFTu)中进行表达。结果显示,PK2基因种间同源性低,山羊PK2基因编码的蛋白由109个氨基酸组成,在蛋白序列的第9～25位间存在一个潜在的跨膜区,具有prokineticin结构域,是结构保守蛋白。ELISA检测表明,成功在OFTu细胞中进行了PK2蛋白的过表达和干扰表达。本研究结果为深入研究PK2基因的上下游信号通路及其在山羊疾病中的致炎机制提供了基础数据和工具。