多重置换扩增技术用于法医学微量DNA检测效果

目的探讨多重置换扩增(MDA)技术对法医学微量DNA样品STR检测分型的效果。方法用MDA技术对不同模板量DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用Profiler PlusTM试剂盒检测基因型。结果该方法可对模板DNA增加104～106倍。1ng样品DNA的MDA产物可获得9个STR基因座和Amelogenin性别基因座的准确分型结果;低于0.1ng的样品DNA经MDA扩增后,基因座检出数增加,但可见等位基因不平衡或丢失现象。结论MDA技术可有效增加DNA模板量和提高微量DNA分型效果。但样品DNA量低于0.1ng时,MDA产物的STR分型结果判读须慎重。     

改良IPEP法用于痕量DNA检测的实验研究

目的探讨改良扩增前引物延伸(IPEP)法对痕量DNA样本STR检测分型的效果。方法用改良IPEP法对痕量样品DNA进行全基因组扩增(WGA),扩增产物用实时荧光定量PCR技术定量、用AmpFLSTR~ Indentifiler~试剂盒作基因型检测。结果该方法可增加模板DNA约200~1100倍。基因组DNA不低于0.025ng时,可获得15个STR基因座和Amelogenin性别基因座的分型结果。基因组DNA0.01~0.025ng时,可获得9个以上基因座的分型结果。结论改良IPEP法可有效提高痕量DNA样本STR分型检验的灵敏度,有较好的实用价值。     

Chelex-100提取生物检材DNA实时PCR定量研究

目的研究Chelex-100法提取的生物检材DNA用量与复合STR分型成功率的关系。方法113份各种生物检材采用Chelex-100法提取DNA，应用Quantifiler人类DNA定量试剂盒在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行实时PCR定量，同时用Identifiler复合扩增系统在ABI 3100遗传分析仪上对这些DNA样品进行STR分型。结果各种生物检材提取的DNA浓度分别为：37份滤纸、纱布血痕0．042～5．28ng／μl，16份口腔拭子1．15—4．21ng／μl，18份烟头0．016～1．46ng／μl，10份肋软骨0．531—14．40ng／μl，8份肌肉5．75—24．80ng／μl，7份指甲0．788—11．50ng／μl，17份精斑0．79～99．50ng／μl。在建立的8μl扩增体系中，根据上述结果，调整用于复合STR扩增的DNA模板量在0．5—3ng之间，大部分样品可获得完全的STR分型。结论Chelex-100法提取的检材DNA模板用量在0．5—3ng之间可得到有效STR扩增，浓度为0．5ng／μl以上的DNA样品，用小体积模板（1μl）比大体积（3μl）模板扩增效果好。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20＋4Y—STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID3．2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0．05～1．00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0．999999999,三联体累计非父排除率达0．999999985,Y—STR单倍型多态性为0．592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

脱落毛发及毛干DNA的STR分型研究

目的探讨脱落毛发及毛干细胞核DNA提取、含量和STR分型问题。方法对脱落毛发或毛干进行DNA提取和定量,使用低扩增体系、增加循环次数和多次平行扩增等方法扩增DNA样本,采用叠加比较的方法分析STR分型。结果15cm脱落毛发样品DNA含量大于0．3ng的样品占52．8％,STR分型成功率为55．6％;15cm毛干样品DNA含量大于0．3ng的样品占30．6％,STR分型成功率为25％。结论采用增加循环次数、多次平行扩增等LCN—STR分型方法和Mini—STR试剂盒有助于脱落毛发及毛千的STR基因座分型获得。     

19个常染色体与4个Y染色体STR复合扩增体系的建立

目的建立19个常染色体STR及Amelogenin和4个Y染色体STR基因座复合扩增体系,并对其效能进行评估。方法用五色荧光标记20+4Y-STR基因座,建立同步扩增检测体系,用ABI 3130XL遗传分析仪对扩增产物进行电泳,GeneMapperID 3.2软件进行基因分型;检测体系的灵敏度、均衡性、稳定性、特异性、同一性和稳定性,并观察混合、降解及微量检材的分型情况。结果采用本文体系,DNA模板量在0.05~1.00ng时,分型准确,均衡性、特异性好;混合、降解及微量检材分型正确。该19个常染色体STR基因座的累计个人识别率大于0.999 999 999,三联体累计非父排除率达0.999 999 985,Y-STR单倍型多态性为0.592。结论本文建立的复合扩增体系分型准确,稳定,在法医学案件检验及数据库建设等方面有良好的应用前景。     

全基因组扩增法应用于低拷贝数DNA检测

目的建立基于多重置换扩增(MDA)技术的全基因组扩增(WGA)方法,实现对低拷贝数(LCN)DNA样品进行分析。方法采用REPLI-g试剂盒对样本进行等温全基因组扩增,扩增产物采用ProfilerPlus试剂盒确定样本的十个STR基因座的等位基因型。结果10pgDNA模板经全基因组扩增后,能够进行DNA分型。结论全基因组扩增可以用于LCN的DNA分析,帮助提高微量物证的检出成功率。     

多重置换扩增在含抑制物检材中的应用

目的研究多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)在含抑制物检材中的抗抑制能力,与磁珠法纯化检材相比较,证明其在法医学中的应用及意义。方法将不同浓度血红素和腐殖酸与样本DNA进行混合,分为MDA处理组、磁珠法处理组和空白对照组,PCR-STR单基因座D3S1358扩增联合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,并应用Amp F詛STR誖IdentifilerTMPlus试剂盒联合毛细管电泳检测。结果血红素质量浓度大于1 ng/μL或腐殖酸质量浓度大于0.1 ng/μL时,空白对照组经单基因座STR检测不能得到扩增产物;磁珠法处理组血红素质量浓度大于100 ng/μL或腐殖酸浓度大于1 ng/μL时,不能够得到扩增产物;MDA处理组各浓度抑制物均能成功扩增,完全不受抑制物影响。结论 MDA技术可消除血红素及腐殖酸的抑制作用,其抗抑制能力优于磁珠法纯化DNA,具有一定的法医学应用意义。     

模板DNA用量对荧光STR复合扩增检测的影响

目的 探讨模板DNA用量对荧光STR复合扩增检测的影响,寻求荧光STR复合扩增检测的最适扩增模板DNA用量。方法 采用模板DNA(9947A)不同的扩增用量,对Profiler Plus试剂盒的基因座进行扩增,在3100型全自动遗传分析仪上作了检测。结果 3100型遗传分析仪检测的最适扩增模板DNA用量在0.31～2.5ng之间。结论 模板DNA量过高或过低均会影响荧光STR复合扩增检测结果的可靠性。     

17个STR基因座快速多重扩增体系的建立及应用

目的建立17个STR基因座多重PCR快速扩增体系。方法采用人血样本提取DNA并定量,用于多重快速扩增体系分型准确性检测;采用标准品9948,设定稀释度,检测体系灵敏度;采用定量男女DNA样本按11种比例混合,检测体系对混合样本的分型能力;在标准品中加入干扰物质血红素和腐植酸,检测体系的抗干扰能力;对5种非人样本进行检测,评价体系的特异性;对实际案例进行检验,评价体系实际应用价值。结果采用本文体系,在65min内,用0.5~2ng DNA模板量能获得较好的扩增效果,分型结果准确稳定,扩增均衡;种属特异性好;血红素≤50μmol/L,腐植酸≤25ng/μL时可不受干扰准确分型;男女混合样本中单一样本量不低于1/10即可进准确进行判断;对实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论本文17个STR基因座快速多重扩增体系可显著缩短扩增时间,技术性能符合实际检案要求,可在实践中选用。