不同保存时间和不同精子数量精斑样本DNA分型比较

目的比较不同保存时间和不同精子数量精斑样本DNA分型的效果。方法制备精斑样本,保存10d的样本采用激光显微捕获30、20、15、10、5、1个精子,用于不同数量精子分型比较;保存10d、214d、375d的样本分别捕获30、20、10个精子,用于不同保存时间分型比较。比较各组检出率、等位基因丢失率和非特异性扩增率,采用χ2检验进行差异比较。结果①不同精子数量分型：捕获10个精子即可得到完整的DNA分型,且随着精子数增多,检出率逐渐提高而等位基因丢失率逐渐降低,30个精子等位基因丢失率为0%,1个精子则可达58.89%;②不同保存时间分型：总趋势是保存时间越短,捕获精子越多检出率越高,10个精子与20、30个精子组比较,均有显著性差异（P〈0.05）;等位基因丢失率及非特异性扩增率则随保存时间的延长而增加,相同保存时间的不同精子数量组之间和相同的精子数量的不同保存时间组之间比较,差异均具有统计学意义（P〈0.05）。结论激光显微捕获精子数目和检材保存时间对DNA分型结果有直接影响。     

15重快速STR复合扩增体系的构建

目的建立一套15重快速STR复合扩增体系。方法选择14个常染色体基因座以及1个性别基因座,采用Fast Start Taq DNA聚合酶系统,以DNA标准品9947A为模板,通过筛选扩增条件、选择热启动酶用量、调整引物平衡、优化快速扩增程序、筛选反应缓冲液、选择反应体系以及筛选添加剂等一系列复合扩增实验,比较各条件下等位基因丢失和非特异性扩增情况。结果在以1 ng DNA为模板、0.4μL聚合酶及10×Fast Start高保真反应缓冲液构成10μL快速体系的条件下,32 min即可获得标准DNA全部15个STR基因座的完整分型,无等位基因丢失和非特异性扩增现象,等位基因均衡性良好。同时,5%甘油、0.01%明胶、0.05%明胶和5 mmol/L硫酸铵可作为PCR扩增过程中拟加入的反应添加剂。结论本研究建立的15重快速STR复合扩增体系可以明显缩短反应时间,提高样品检测效率。     

17个STR基因座快速多重扩增体系的建立及应用

目的建立17个STR基因座多重PCR快速扩增体系。方法采用人血样本提取DNA并定量,用于多重快速扩增体系分型准确性检测;采用标准品9948,设定稀释度,检测体系灵敏度;采用定量男女DNA样本按11种比例混合,检测体系对混合样本的分型能力;在标准品中加入干扰物质血红素和腐植酸,检测体系的抗干扰能力;对5种非人样本进行检测,评价体系的特异性;对实际案例进行检验,评价体系实际应用价值。结果采用本文体系,在65min内,用0.5~2ng DNA模板量能获得较好的扩增效果,分型结果准确稳定,扩增均衡;种属特异性好;血红素≤50μmol/L,腐植酸≤25ng/μL时可不受干扰准确分型;男女混合样本中单一样本量不低于1/10即可进准确进行判断;对实际案例常见生物检材的检验结果良好。结论本文17个STR基因座快速多重扩增体系可显著缩短扩增时间,技术性能符合实际检案要求,可在实践中选用。     

单细胞分离荧光原位杂交法用于男女混合血DNA分型

目的采用单细胞分离荧光原位杂交法精确分离混合血样中男性和女性细胞并进行分型检验。方法收集男、女性血,按照男∶女为1∶5、1∶10、1∶20制备混合血样,加入0.075mol/L KCl 600μL,轻混、放置30min后加入150μL固定液离心留沉淀涂片,利用Vysis 30-161050试剂盒进行荧光原位杂交,并用PALM激光显微捕获系统分离出男、女性细胞,使用Identifiler试剂盒复合扩增并进行检测。结果捕获8个血细胞即可得到完整的DNA分型,且随着细胞数目的增多,检出率逐渐提高而等位基因丢失率逐渐降低。10个血细胞的检出率最高,为93.75%。5μL男性血液与本实验各比例女性血混合用本文方法检验均可获得男性分型。案例混合血斑经检验获得单一男性和女性分型。结论单细胞分离荧光原位杂交法可用于男女混合血样本中DNA分型检验。