噬菌体制剂沙立宁对鹅源沙门菌感染的抑菌效果研究

为了探讨噬菌体制剂沙立宁对鹅源沙门菌的抑菌效果,本研究选取血清型分别是鼠伤寒沙门菌和乙型副伤寒沙门菌的2株鹅源沙门菌,首先利用改良寇氏法计算2株菌的半数致死量(LD_(50)),然后利用2株菌人工感染3日龄SPF雏鸡,再用噬菌体制剂沙立宁和头孢噻肟处理感染后的SPF雏鸡,观察雏鸡的临床症状及内脏解剖学变化,检测肝和盲肠的载菌量及两种组织的病理组织学变化。结果显示,鼠伤寒沙门菌和乙型副伤寒沙门菌的LD_(50)分别为1.43×10~7CFU/mL和4.40×10~6CFU/mL;感染2株沙门菌后,雏鸡表现精神萎顿、垂头呆立、闭眼昏睡、绒毛松乱、食欲减退、排白色浆糊状稀便,严重者全身抽搐、呼吸困难,甚至死亡。雏鸡肝中的载菌量随着感染时间延长呈先增加后减少的现象,盲肠载菌量则表现为逐渐减少。组织学方面,肝细胞出现肿胀、胞质疏松、炎性细胞浸润现象,盲肠则表现出固有层炎性细胞浸润、绒毛断裂现象。利用噬菌体制剂沙立宁和头孢噻肟治疗后,雏鸡肝和盲肠载菌量明显减少,两种组织形态趋于恢复正常,炎症反应减轻或消失。结果表明,鹅源沙门菌可以感染雏鸡,噬菌体制剂沙立宁和头孢噻肟对2株鹅源沙门菌的感染均具有抑制效果。     

沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

以1株肠炎沙门菌(CICC21482)为宿主菌,从湖北省某规模化养猪场的污水中分离得到1株烈性沙门菌噬菌体,命名为SP01,并对其生物学特性进行了初步研究。采用双层平板法筛选并纯化噬菌体,观察噬菌斑的形态;采用透射电镜观察SP01颗粒;酚-氯仿法提取SP01核酸,酶切分析其核酸类型。同时对噬菌体SP01的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)、一步生长曲线、热稳定性、p H稳定性、噬菌体SP01对细菌的裂解曲线及裂解谱等生物学特性进行了研究。结果,噬菌体SP01噬菌斑形态呈圆形、透亮,边界清晰,无晕环,直径约为1~2 mm;电镜下可见噬菌体SP01有一正多面体立体对称头部,直径约63 nm,含非收缩性尾部,尾长约158 nm,为长尾科噬菌体;提取基因组,酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA;当MOI=0.1时,子代噬菌体滴度较高;噬菌体SP01除对本身宿主菌产生裂解外,还裂解猪霍乱沙门菌和都柏林沙门菌;一步生长曲线试验结果显示,其感染宿主菌的潜伏期约为20 min,裂解期约为60 min,平均裂解量约为120 PFU/cell;噬菌体SP01在20~40℃稳定,在p H=4.0~11.0稳定;对体外培养的特定血清型的沙门菌具有良好的裂菌效果。上述结果表明,噬菌体SP01为1株沙门菌烈性噬菌体,对不同温度、p H的环境均有较强的适应能力且杀菌能力较强,具有开发为抗沙门菌制剂的潜力。     

沙门菌CRISPR与耐药性的关系及生物信息学分析

为研究沙门菌成簇间隔短回文重复序列(CRISPR),对CRISPR进行生物信息学分析,为进一步研究CRISPR功能及其对细菌耐药的影响奠定基础。对合肥市宠物医院分离鉴定的14株沙门菌进行耐药性(24种抗菌药物)和CRISPR检测,分析CRISPR与沙门菌多重耐药的关系。对沙门菌PCR产物进行测序,通过BLAST、RN A二级结构预测、CRISPR Target等生物信息学方法对沙门菌的CRISPR进行生物信息学分析。结果显示,沙门菌均对3种及3种以上药物耐药,有8株菌检测到CRISPR 1,14株菌检测到CRISPR2;CRISPR阳性菌株均为多重耐药菌株,CRISPR序列差异性与耐药性之间没有直接相关性,CRISPR序列与血清型之间有一定相关性。8株CRISPR 1阳性沙门菌重复序列均含1条(9、13号除外)长度为29 bp的重复序列,分为4类,14株沙门菌CRISPR 2的重复序列共有18类,其RNA二级结构都能形成回文结构,但茎环大小有差异。同源性比对发现,CRISPR 1中81.6%的间隔序列与质粒的基因组序列具有同源性,18.4%与噬菌体有同源性;CRISPR 2中80%的间隔序列与质粒具有同源性,16.8%与噬菌体有同源性,3.2%与细菌有同源性。结果表明,携带CRISPR的沙门菌广泛存在,CRISPR可能与沙门菌血清型相关,明确了CRISPR结构的生物学信息。     

鸡白痢沙门菌基因组差异片段的筛选与分析

采用抑制性消减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株进行了基因组差异片段分析。结果,从C79-13株中共检出13个特异性差异片段。经同源分析,这些序列可分为3类:噬菌体相关序列、质粒相关序列和已知功能序列。这些差异片段包含一些重要的沙门菌毒力相关基因,如编码大肠杆菌素I、paJ蛋白、尾突蛋白、切除酶的基因。结果表明,鸡白痢沙门菌C79-13株与鸡伤寒沙门菌Sg9株基因组间存在较多差异基因,这些差异片段为确定鸡白痢沙门菌特异性遗传标志,建立分子鉴别新体系提供了基础。     

鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp的构建及鉴定

为研制安全有效的鸡伤寒沙门菌减毒株,首先利用自杀质粒介导的同源重组技术构建鸡伤寒沙门菌1009株的spic基因缺失株1009Δspic,在此基础上,运用λ噬菌体同源重组系统进一步敲除crp基因,以构建鸡伤寒沙门菌双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。PCR和测序鉴定结果表明,成功构建出双基因缺失株1009ΔspicΔcrp。生物学特性研究结果显示,1009株spic和crp基因的缺失能够得到稳定的遗传,部分生化特性发生了变化,生长速度较缓慢,对雏鸡的LD50升高了107倍。本研究获得的高度安全的鸡伤寒沙门菌减毒株为进一步研制鸡伤寒沙门菌减毒疫苗奠定了基础。     

产志贺毒素大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_PHB05的生物学特性及全基因组分析

产志贺毒素大肠杆菌又称产Vero细胞毒素大肠杆菌,是一种可引起水样腹泻、溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎等的人兽共患肠道致病菌。以一株产志贺毒素大肠杆菌为宿主菌,从湖北某规模化养猪场的污水中分离得到一株烈性产志贺毒素大肠杆菌噬菌体,命名为v B_Eco M_PHB05。采用双层平板法筛选并纯化得到一株噬菌体,采用透射电镜观察噬菌体颗粒;使用Ion Torrent测序平台进行噬菌体全基因组测序,同时对噬菌体最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线、裂解谱等生物学特性进行研究。结果表明,噬菌体v B_Eco M_PHB05在电镜下可见有一正多面体立体对称头部(直径约72 nm),含收缩性尾部(尾长约45 nm,尾宽20 nm),为肌尾科噬菌体;提取基因组,酶切鉴定该噬菌体核酸类型为双链DNA;其最佳感染复数为0.1;一步生长曲线试验结果显示,噬菌体v B_Eco M_PHB05潜伏期约为20 min,平均裂解量约58 PFU/cell;基因测序结果表明,该噬菌体全基因组全长147 659 bp,G+C含量37.5%。噬菌体v B_Eco M_PHB05除对本身宿主菌产志贺毒素大肠杆菌(Escherichia coli O34)产生裂解外,还裂解其它产志贺毒素大肠杆菌和沙门菌。噬菌体v B_Eco M_PHB05为一株广谱烈性噬菌体,其基因组中不含耐药基因及毒力基因,具有开发为抗产志贺毒素大肠杆菌制剂的潜力。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeatse和hisJ基因片段的引物序列 ,设计并合成了 2对引物 ,对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果 ,沙门菌PCR产物均出现 199bp与 4 95bp的特异性DNA扩增条带 ,而非沙门菌均未出现扩增条带 ,证明这 2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释 ,测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明 ,此体系可检出 10 3CFU/mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法 ,对进境鱼粉阳性样品进行了检测 ,均出现阳性结果。本研究表明 ,复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法 ,可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同,设计和合成了等位基因特异性PCR引物,建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法,并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示,该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌,检测灵敏度达100 pgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定,鉴定出33株鸡白痢沙门菌,符合率为94.3%。表明,建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

沙门菌毒力基因多重PCR检测方法的建立及应用

通过建立沙门菌不同毒力岛基因的多重PCR,对沙门菌毒力基因进行快速、灵敏的检测。根据GenBank中的序列设计合成16对引物,优化反应条件,建立了4组多重PCR,通过倍比稀释模板检测多重PCR的敏感性。利用建立的多重PCR对124株沙门菌进行毒力基因分布检测,验证多重PCR的实用性。电泳结果显示,多重PCR体系可有效扩增出每个目的基因。4组多重PCR体系的DNA敏感性分别为50、10、50、100pg;菌液敏感性分别为1×104、1×104、1×105、1×105 CFU。多重PCR与单基因PCR检测沙门菌毒力基因的结果一致。结果表明,本研究建立的多重PCR可有效检测沙门菌毒力岛基因,特异性强,灵敏度高,耗时短;还可用于沙门菌毒力基因的鉴定及分子流行病学调查。     

进口鱼粉和肉骨粉病原性沙门菌的分离鉴定及其16S rRNA序列的同源性分析

从进口的 17批饲料用鱼粉、肉骨粉样品中分离得到 4株细菌 ,采用生化和血清学方法鉴定 ,提取其DNA ,用细菌 16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增 ,并对PCR扩增产物测序 ,将测定的 16SrRNA序列在NCBI数据库中进行序列同源性比较 ,确证为沙门菌 ,其中样品 2、8与鼠伤寒沙门菌的序列同源性大于 99% ,样品 10、11与伤寒沙门菌的序列同源性大于 99%。由此可以认定样品 2、8为鼠伤寒沙门菌 ,样品 10、11为伤寒沙门菌     

白鸡屎藤挥发油抗肠炎沙门菌内毒素作用的分析

为了探讨白鸡屎藤挥发油抗肠炎沙门菌内毒素的作用,将420只7日龄三黄鸡随机分成A、B、C、D、E、F组并对A、B、C组鸡按100μg/mL(1mL)预防用药,在12日龄时对A、B、D、E组口服肠炎沙门菌攻毒,攻毒24h后对A、D组按100μg/mL白鸡屎藤挥发油1mL进行滴鼻给药治疗,同时将不同质量浓度的白鸡屎藤挥发油与内毒素混合对另外90只雏鸡进行肌肉注射攻毒,并进行试验鸡与攻毒鸡临床死亡情况统计、病理组织学观察和肝与血液生化指标测定。结果显示,白鸡屎藤挥发油对肠炎沙门菌内毒素具有灭活作用,可缓解血清ALT和AST活性的升高或使其降低(P<0.01或P<0.05),提升肝及血清中SOD的活性(P<0.01或P<0.05),使肝中MDA含量下降和延缓其升高。结果表明,白鸡屎藤挥发油具有抗肠炎沙门菌内毒素的作用,其机理与其保肝作用和抗氧化损伤作用有关。     

禽沙门菌分离株耐药性及Ⅰ类整合子的检测

为了分析禽沙门菌临床分禽株出现多重耐药的原因,采用Kirby-Bauer纸片扩散法对61株禽沙门菌分离株进行药敏试验筛选,通过PCR方法检测59株多重耐药沙门菌的Ⅰ类整合子的5’-CS端、3’-CS端和可变区基因并进行测序分析。药敏试验结果显示,所分离的禽沙门菌对青霉素、苯唑西林、利福平和万古霉素的耐药率均达到了100%,但对美福仙、诺氟沙星、阿米卡星、卡那霉素、氯霉素、氟苯尼考相对敏感;96.72%沙门菌能耐受6种及其以上抗菌药物,说明沙门菌的多重耐药性比例高。通过PCR及测序发现,5株禽沙门菌(8.5%)中检测到Ⅰ类整合子基因盒,包括4株雏沙门菌和1株肠炎沙门菌。序列分析结果显示,Ⅰ类整合子基因盒的核苷酸同源性达到100%;通过NCBI的BLAST分析发现,Ⅰ类整合子基因盒内含有dfr17和aad A5基因。因此,尽管禽沙门菌分离株的多重耐药性比例高,但是仅有少数菌株的耐药性与Ⅰ类整合子相关。     

猪沙门菌分离株的毒力及耐药特征

为了检测哈尔滨市猪沙门菌分离株的毒力及耐药情况,对采自健康猪群的非重复35株沙门菌进行了血清型鉴定、人工感染及毒力试验、药敏试验、耐药基因的检测与转移试验。结果显示,检出的最主要血清型为猪霍乱沙门菌,共25株,占71.4%(25/35),其次为猪伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌。被攻毒小鼠全部死亡,肝、脾、胃出现不同程度的出血性病变。大部分沙门菌株对临床常用的抗菌药物已产生多重耐药,其中对氨苄青霉素、氟喹诺酮类、四环素和氨基糖苷类抗生素的耐药性较高,而碳青霉烯类抗生素的体外活性较高。结果表明,碳青霉烯类抗生素可作为临床治疗沙门菌病的首选药物之一。     

一株铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究

为控制铜绿假单胞菌的感染或污染提供生物制剂,分离到1株新的铜绿假单胞菌噬菌体,并研究其生物学特性。以铜绿假单胞菌为宿主细菌,从山西太谷某养鸡场的污水粪便混合物中分离出噬菌体。采用双层琼脂法对该噬菌体进行了分离和表征鉴定,用透射电镜（TEM）观察噬菌体的形态和大小,同时测定了噬菌体滴度、感染复数（MOI）、体外抑菌活性、一步生长曲线、温度、pH和氯仿稳定性。提取分离的噬菌体DNA,通过测序方法进行序列分析。结果显示,本研究分离出1株铜绿假单胞菌的烈性噬菌体,透射电镜显示该噬菌体属于肌病毒科,命名为v B＿PaeM＿TG2。噬菌斑大小为1～2 mm,最佳MOI为0.1,潜伏期约为10 min,暴发期约为30 min。v B＿PaeM＿TG2对温度、氯仿和pH具有良好的耐受性。v B＿PaeM＿TG2是双链环状DNA,基因组大小为206 910 bp,平均GC含量为62.07%,预测有387个开放阅读框。结果表明,分离的铜绿假单胞菌噬菌体v B＿PaeM＿TG2潜伏期较短,裂解能力强,在高温、高氯仿浓度和宽pH范围下比较稳定。本研究为铜绿假单胞杆菌病的防治提供了新的理论支持。     

四川部分区域鸽源沙门菌携带情况的调查及其部分生物学特性的分析

为了解四川部分区域鸽源沙门菌的病原携带情况及分离菌的部分生物学特性,笔者采用RTPCR对四川部分区域采集的1 375羽赛鸽、信鸽的肛门拭子、粪便样本开展了沙门菌携带情况的调查,检测分离鉴定得到的沙门菌部分毒力基因。结果鉴定出52株沙门菌,检出率为3.85%(95%置信区间为2.81%～4.85%),以双流区、郫都检出率较高,分别为11.23%(9/81)和11.11%(10/89),各区域间检出率差异极显著(P0.01)。甲型副伤寒沙门菌、纽波特沙门菌均占定型菌株的11.9%,定型菌毒力基因sipC占比为92.85%,提示分离株有较强的入侵非吞噬细胞的能力。结果丰富了鸽源沙门菌携带情况的相关资料,为鸽源沙门菌的深入研究及防控提供了参考。     

一株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究

本研究旨在分离鉴定奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体,并研究其生物学特性。利用双层琼脂噬菌斑法从生活污水中分离金黄色葡萄球菌噬菌体;通过核酸酶处理分析核酸类型;采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;同时测定其最佳感染复数、一步生长曲线和裂解谱。结果显示,本研究分离到1株烈性金黄色葡萄球菌dsDNA噬菌体,命名为噬菌体SAGD1。该噬菌体头部呈二十面体,直径约98nm,有一带伸缩尾鞘的长尾,大小约14nm×200nm,属于肌尾噬菌体科。该噬菌体的最佳感染复数为0.01;感染宿主菌潜伏期约20min,裂解期约30min,裂解量为80。且该噬菌体能裂解1株表皮葡萄球菌及35株金黄色葡萄球菌。结果表明,本研究分离的烈性噬菌体具有金黄色葡萄球菌生物抑菌剂的应用潜力。     

鸡源唾液乳杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为筛选出对禽沙门菌具有显著拮抗效应的益生菌,从健康肉鸡消化道分离菌株,经细菌形态观察、生化试验鉴定及16S rDNA基因序列分析,共鉴定出14株唾液乳杆菌。体外琼脂扩散试验结果显示,WLS001、WLS002、WLS003、WLS004这4株分离株分别对鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌具有明显抑制作用。pH及胆盐耐受性试验结果表明,WLS001耐受性最强,在pH为2.0、胆盐浓度0.2%条件下均能生存。药敏结果显示,4株菌均对万古霉素耐药。安全性试验表明,所有唾液乳杆菌均没有溶血环,试验组雏鸡体重较对照组增重显著(P0.05)。组织病理切片显示,脾、肝、盲肠及十二指肠形态均正常。结果表明,4株鸡源唾液乳杆菌具有良好的生物学特性和安全性,具备进一步开发微生态制剂的潜力。     

肉鸽都柏林沙门菌感染的检验与分析

沙门菌属(Salmonella)细菌的某些种(血清型) ,是引起禽类细菌性传染病的重要病原菌,在世界各地均有不同程度的暴发与流行,不仅影响禽的生长发育,降低其商品价值,甚至导致禽大批死亡,给养禽业造成严重的经济损失。在我国检出率较高的有鸡白痢沙门菌、鸡伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌和都柏林沙门菌等。笔者在禽病的研究工作中,对一起发生在肉鸽以纤维素性肺炎为主要特征病变的病例进行了检验,经对病原细菌分离、鉴定,确诊为由都柏林沙门菌所引起。1　发病情况与临床症状唐山某养殖户饲养的15 0只4 0日龄商品肉鸽突然发病,送检时已发…     

肠炎沙门菌sipA基因缺失株C50336ΔsipA的构建及鉴定

为研究sipA基因对肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)的生物学特性的影响,利用λ-Red同源重组系统构建肠炎沙门菌C50336的sipA基因缺失株,同时将sipA基因克隆至pBR322质粒,将回补质粒电转化至缺失株,成功构建了回补株。通过比较肠炎沙门菌野生株、缺失株以及回补株在生长特性、生化特性、遗传稳定性、对小鼠的半数致死量以及对Caco-2细胞的黏附侵袭能力的差异,发现肠炎沙门菌sipA基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与野生株及回补株相比,其生长特性和生化特性未发生明显改变,对8周龄小鼠的毒力没有显著变化,不影响细菌对Caco-2细胞的黏附能力,但对Caco-2细胞的侵袭能力明显下降。上述研究结果为进一步研究sipA基因在肠炎沙门菌感染过程中的功能奠定了基础。