流产布鲁氏菌omp25基因的克隆与原核表达

用设计的1对特异性引物对流产布鲁氏菌2型CVCC70502株总DNA进行外膜蛋白基因omp25的PCR扩增,得到了1条完整的基因,大小为642 bp;测序分析证明,它与国外报道的流产布鲁氏菌omp25基因的核苷酸序列完全一致。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,经酶切、PCR扩增和测序分析,表明重组表达载体构建成功。将此重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约50 ku的融合蛋白,与理论推测的蛋白分子质量一致;Western-blotting试验证明,表达蛋白OMP25可被流产布鲁氏菌阳性血清所识别。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因的克隆与原核表达

为克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因,并对其表达产物的反应原性进行研究,用设计的1对特异性引物对兔多杀性巴氏杆菌CVCC500株总DNA进行ompH2基因的PCR扩增。将PCR片段克隆至pMD18-T载体中,进行测序。随后,将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,将重组表达质粒pET30a(+)-ompH2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。测序分析证明,得到了1条大小为1 052bp的基因片段,与国内外报道的兔多杀性巴氏杆菌ompH2基因的核苷酸序列相似性达99%以上。重组表达质粒的酶切鉴定、PCR扩增和测序分析表明,重组表达载体构建成功。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约47ku的融合蛋白。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白ompH2具有反应原性。为研究兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2的免疫学活性奠定了基础。     

基于牛布氏杆菌重组外膜蛋白的混合抗原间接ELISA方法的建立

为建立布鲁菌的快速检测方法,通过引物设计、PCR扩增、表达载体构建、SDS-PAGE和Western-blot分析对牛布鲁菌3种外膜蛋白OMP19、OMP22、OMP28基因进行原核表达,利用亲和层析法纯化3种重组蛋白,将3种重组蛋白混合作为包被抗原,经重复性、灵敏度和特异性试验建立了布鲁菌抗体检测间接ELISA,并对300份牛血清样品进行检测应用,同时使用进口的商品化试剂盒进行平行检测。结果显示,成功构建了p Cold-TF/OMP19、p Cold-TF/OMP22和p Cold-TF/OMP28原核表达载体,诱导后分别表达大小分别为69、74和80 ku的可溶性且具有良好反应原性的重组蛋白r OMP19、r OMP22和r OMP28。基于此3种重组蛋白混合抗原建立的间接ELISA具有良好的重复性和特异性,其灵敏度达1∶1 600。临床样品检测试验结果显示,与进口试剂盒总符合率高达96%(288/300),其中阳性符合率为93.5%(58/62),阴性样品符合率为96.64%(230/238)。将3种重组外膜蛋白联合作为包被抗原进行牛布鲁菌抗体检测,为我国牛布鲁菌病的诊断检测技术相关研究提供了新的思路和参考。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

马尔他布氏杆菌LpxK基因的克隆及原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。     

猪大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的克隆及原核表达

从河北省部分地区病猪中分离大肠杆菌,根据GenBank中登录的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术扩增LTB的编码基因,得到一条375bp的片段。将其连入Simple-T载体中,经酶切、PCR及序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,并用IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot进行分析。结果显示,LTB基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为14ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与大肠杆菌免疫血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为大肠杆菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌黏附素FnBPB-ClFA共表达质粒的构建与原核表达

采用PCR方法对编码金黄色葡萄球菌纤黏蛋白B的D区和纤黏蛋白原凝集素A的A区基因片段进行了特异性扩增,并通过重叠延伸PCR扩增了FnBPB-ClFA串联基因,构建了克隆质粒pMD19-FnB-PB-ClFA。将该基因片段定向插入到原核表达载体pET-32a(+)中,构建了表达质粒pET-FnBPB-ClFA,并将其转入宿主菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,在1mmol/L IPTG诱导下,在51ku处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带。Western-blot分析表明,所表达的蛋白与目的蛋白一致。上述结果表明,该融合基因在原核细胞中成功表达。     

牛型布鲁氏菌A19株外膜蛋白OMP2b的表达及鉴定

根据GenBank中的牛型布鲁氏菌基因序列,设计了1对特异性引物,以A19菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出外膜蛋白OMP2b的全长基因,将OMP2b经T-A克隆后进行了序列测定和分析。结果表明,OMP2b全长1 128bp,编码376个氨基酸。将OMP2b定向克隆至表达载体pCold TF中,构建重组表达质粒pCold TF-OMP2b,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白His-OMP2b。SDS-PAGE分析结果显示,His-OMP2b约为93ku,与预期大小一致,表明His-OMP2b表达成功;经Wes-tern-blot分析,His-OMP2b能与牛型布鲁氏菌A19株全菌兔抗血清发生特异性反应,表明His-OMP2b具有免疫反应性。     

猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了制备猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)核衣壳(N)蛋白多克隆抗体,采用PCR方法扩增SADS-CoV/CN/GDGL/2017毒株N基因片段,并对N基因的序列以及N蛋白氨基酸突变位点进行分析。随后,将N基因片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行原核表达,用Ni-NTA亲和层析柱纯化N蛋白,通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体。结果表明,扩增的N基因片段和所构建的重组质粒正确无误,成功诱导表达出可溶性重组蛋白SADS-CoV-N,分子质量约为67 ku,最佳诱导时间为6 h。Western-blot以及间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体能特异性检测SADS-CoV,证明重组蛋白有良好的免疫原性。本研究为后续建立SADS-CoV快速诊断方法及该病毒致病机制的深入研究奠定基础。     

我国对外关系大事记(2001年11月1日-12月31日)

亚　洲　　11月1日　外交部发言人朱邦造在新闻发布会上说，中国与东盟建立自由贸易区符合双方的共同利益；中国政府在处决韩籍犯人申玉斗时事先通知了韩国方面。中方希望韩方停止对中方的不实指责。　　11月1日　迟浩田国防部长会见尼泊尔国防秘书阿查里雅一行。　　11月5日     

我国对外关系大事记(2000年9月10日～10月31日)

9月10日胡锦涛副主席会见土耳其国防部长萨巴赫丁·恰克马克奥卢一行。9月11日江主席会见正在北京休养的柬埔寨国王诺罗敦·西哈努克和莫尼列克王后。9月12日朱基总理会见以日本自民党国会对策副委员长逢泽一郎为团长的日本年轻众议员访华团一行。9月12日外交部发言人孙玉玺答记者问时说，日本“教科书问题”的实质是日本自身能否切实正确认识和对待过去那段侵略历史，真正从中汲取教训，不再走回头路。希望日方以实际行动履行以往的表态和承诺。9月15日江主席和朱总理分别致电柬埔寨国王西哈努克和洪森首相，对柬遭受水灾表示慰问。9月18…     

需氧芽胞杆菌DX31株预防仔猪黄痢的效果

从微生态学的角度看,仔猪黄痢主要因其肠道内菌群失调所致,下痢仔猪肠道中的致病性大肠埃希氏菌显著增加,拟杆菌、双歧杆菌等专性厌氧菌显著减少。因此,应用非致病性活菌制剂(微生态制剂),恢复肠道的微生态平衡,以达到预防肠道疾病的方法已越来越受到人们的重视。目前广泛...     

我国对外关系大事记(2000年11月1日～12月31日)

亚洲11月1日　江泽民主席就新加坡航空公司一客机失事致电新加坡总统纳丹，向遇难者家属表示慰问。　　11月6日　李岚清副总理会见印度人力开发部长兼科技部长穆利·乔希一行。　　11月11日　江主席访问老挝。12日，江主席与老挝国家主席坎代·西潘敦会谈。同日，江主席分别会见国会主席沙曼·维雅吉、总理西沙瓦·乔本潘和前国家主席诺哈。　　11月12日　越共中央总书记黎可漂会见来访的中联部部长戴秉国。　　11月13日　江主席访问柬埔寨，分别会见柬埔寨国王西哈努克、国民议会议长拉那烈亲王、参议院议长谢辛和首相洪森。同日，西哈努克…