单增李斯特菌四环素耐药基因tetM膜接合转移的研究

为探讨猪链球菌能否成为单增李斯特菌四环素耐药基因tetM的水平传播宿主,以携带该基因的单增李斯特菌四环素耐药菌株为供体菌株,猪链球菌的红霉素耐药菌株为受体菌株进行滤膜接合试验。同时对供体菌株进行了转移相关基因int-Tn的PCR检测。结果显示,获得19个接合子,接合转移率为4×10-7。接合子均对四环素耐药,且接合子中均PCR扩增到tetM基因,该基因克隆测序结果与供体菌中tetM基因序列完全一致。同时,从供体菌株中扩增到整合酶编码基因int-Tn。这说明猪链球菌可以成为单增李斯特菌四环素耐药基因tetM的水平传播宿主,并且该基因的水平转移与整合子有密切关系。     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a( )中,得到重组质粒pET64-85。该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21(DE3)转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2 螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

猪传染性胸膜肺炎重组亚单位疫苗保护效果的评价及其免疫机制的研究

分别表达了rApxⅠr、ApxⅡr、ApxⅢ、rApxⅣr、Apfa和rOMP 6种重组蛋白,以不同组合分组免疫小鼠,分别以APP1型菌(5×109CFU)和APP7型菌(1×1011CFU)进行攻毒。结果显示,试验Ⅱ组(rApxⅠ rApxⅡ rApxⅢ rOMP)的APXⅠ抗体水平、细胞免疫水平及对APP1和APP7型菌的保护效果均显著高于其他各试验组及对照组;试验Ⅰ组(灭活疫苗)、Ⅲ组(rApxⅠ rApxⅡ rApxⅢ rApxⅣ)、Ⅳ组(rApxⅠ rApxⅡ rApxⅢ rApfa)与对照组差异显著,但均显著低于试验Ⅱ组;APXⅠ抗体水平和细胞免疫水平与攻毒保护率呈正相关。证实rApxⅠ rApxⅡ rApxⅢ rOMP组免疫效果最好,可对2个血清型APP的攻击提供有效保护。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣA 2.5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株721株基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2.5kb特异片段,将其克隆于pMD18T中,经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定,并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AX002405)基因进行比较,结果显示核苷酸同源性为99.5%。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX6P1的EcoRⅠ/SalⅠ位点,成功地构建了重组表达载体pGEXapxⅣA,并转化大肠埃希氏菌BL21,获得了表达。SDSPAGE检测结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为117ku,与预期片段大小相符;Westernblotting分析证实,该融合蛋白具有免疫学活性。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白基因的克隆和表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清7型25-4株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜蛋白(OMP)基因特异片段,并克隆于pMD 18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pGEX-6P-1,成功构建了重组表达载体pGEX-omp;以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),经SDS-PAGE鉴定,表达的可溶性融合蛋白分子质量约为61 ku,命名为GST-OMP。以GST亲和层析柱纯化并利用Xa因子酶解,获得切掉标签的OMP。经ELISA检测,该OMP蛋白能够与兔抗APP的阳性血清反应,具有很好的免疫活性。GST-OMP蛋白的成功表达为APPOMP相关分子生物学功能的研制奠定了基础。     

重组ApxⅡA对胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫效果的影响

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ毒素的结构基因ApxⅡA克隆到原核表达载体 pGEX-6P-1,并在大肠埃希氏菌中进行了表达,表达产物rApxⅡA以包涵体形式存在。为了检测 rApxⅡA的免疫原性,分别用rApxⅡA、灭活疫苗以及灭活疫苗添加rApxⅡA对比利时白兔进行了免疫。免疫后进行攻毒,所用菌株分别为同型菌株(APP7型L25-4株)和异型菌株(APP1型 4074株)。结果,免疫动物对相同血清型菌株的攻击获得完全保护,且对异型菌的攻击也获得一定保护作用。表明,rApxⅡA蛋白具有良好的免疫原性,作为抗原成分添加到灭活疫苗中后可提高灭活疫苗的免疫效果。