猪源多聚免疫球蛋白受体的表达及抗血清的制备

为了制备猪源pIgR蛋白的多克隆抗体,分析NCBI提供的猪源pIgR的胞外区基因序列并设计引物,经过PCR、酶切、连接,将目的 序列克隆入原核表达载体pET-30a(+),测序验证成功后,将带有目的 片段的重组质粒转化入大肠杆菌(E.coli) BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层...     

安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白基因与热休克蛋白70基因的重组联合表达

利用双酶切方法将安氏隐孢子虫热休克蛋白70(HSP70)基因部分编码区连接到含有安氏隐孢子虫卵囊壁蛋白基因(COWP)的表达质粒pET-32a-COWP上,构建了表达质粒pET-32a-COWP-HSP70。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,30℃,经1.5mmol/L IPTG诱导表达6h,表达产物主要以可溶的形式表达。使用小鼠抗安氏隐孢子虫超免疫血清为第一抗体进行Western-blot检测,结果有明显的目的条带出现,说明重组蛋白能被抗安氏隐孢子虫抗体识别。     

马尔他布氏杆菌LpxK基因的克隆及原核表达

为了克隆马尔他布氏杆菌LpxK基因并对其进行原核表达,根据GenBank中马尔他布氏杆菌M5-90株LpxK基因序列信息设计引物,从M5-90株基因组扩增出1 026bp的目的基因;然后将其连接入pMD20-T载体,转化入大肠杆菌DH5α并测序;测序正确后将目的基因连接入pET-28a(+)质粒,构建重组质粒pET-28a(+)-LpxK,并将其转化入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western-blot鉴定诱导表达的蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a(+)-LpxK原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了LpxK基因,表达的融合蛋白大小约41ku且主要以包涵体形式存在。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

鸡毒支原体醛缩酶的原核表达及膜定位鉴定

为了探明醛缩酶在支原体中的定位,根据已发表的鸡毒支原体醛缩酶(fba)基因序列设计特异性的引物,以鸡毒支原体Rlow株基因组为模板,通过Overlap PCR点突变扩增鸡毒支原体醛缩酶fba基因,将fba克隆至pET-28a(+)载体后进行序列测定和分析。结果表明,fba基因全长873bp,编码290个氨基酸。将构建的重组表达质粒pET28a-fba转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下成功获得表达融合蛋白rMGfba,大小约为33ku。纯化蛋白并对蛋白进行酶活性检测,结果显示该酶在体外具有与阳性对照醛缩酶相同的催化功能。用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,提取鸡毒支原体膜蛋白,Western-blot分析结果显示FBA多抗可与疏水性膜蛋白特异性结合,说明FBA位于鸡毒支原体膜表面。     

滑液支原体DnaK的原核表达及免疫原性分析和亚细胞定位

参照GenBank中滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)WVU1853株dnaK基因序列(CP011096.1)设计并合成特异性引物,利用overlap PCR技术扩增获得MS dnaK基因,并将其克隆至pMD19-T载体,在序列分析的基础上将该基因克隆至pET-28a(+)质粒,构建原核表达载体pET-dnaK并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,进行SDS-PAGE分析。继而将纯化表达产物免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA、Western-blot和免疫荧光试验对MS DnaK的免疫原性及其在细胞内的分布进行分析。结果显示,MS dna K基因全长1 791 bp,编码596个氨基酸,重组蛋白rMSDnaK在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,且其相对分子质量约为67 ku。间接ELISA和Western-blot结果表明,rMSDnaK具有良好的免疫原性,且MS DnaK在其胞浆和胞膜中均有分布,但在胞膜中含量较多,免疫荧光试验进一步证实DnaK在MS膜表面的分布。本研究结果为进一步研究MS DnaK的生物学功能奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

弓形虫硫氧还蛋白样蛋白基因的克隆与原核表达

为掌握刚地弓形虫硫氧还蛋白样蛋白(thioredoxin-like,TRXL)的生物学特性及其作为诊断候选分子的潜力,针对trxl基因序列设计引物,通过RT-PCR法扩增弓形虫trxl基因,并将其连接至pET-30a(+)原核表达载体。转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,分析了rTRXL蛋白的反应原性。结果显示,弓形虫trxl基因全长1 275bp,共编码424个氨基酸,与GenBank中下载的弓形虫ME49株trxl基因的参考序列完全一致。SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白rTRXL的大小约48ku,与预期的结果相符,主要以包涵体形式存在。Western-blot结果显示,重组蛋白rTRXL能被感染弓形虫的猪阳性血清识别,表明重组蛋白rTRXL具有良好的反应原性。上述研究结果为弓形虫rTRXL蛋白作为新型弓形虫诊断试剂候选抗原的研究奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒△Gp5/M/N串联基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR方法从猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株VR2332中扩增△Gp5、M和N基因片段,通过重组PCR方法得到串联基因△Gp5/M/N,将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)pLysS,筛选表达PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白的菌株.经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和western-blotting.结果表明,PRRSV pET-△Gp5/M/N蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,纯化后的蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应.证明原核表达系统表达的PRRSV pET-AGp5/M/N蛋白具有良好的反应原性.     

猪圆环病毒Ⅰ型ORF1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中猪圆环病毒Ⅰ型(PCV1)ORF1基因序列,设计合成了1对引物,对PCV1 ORF1基因进行PCR扩增,将扩增出的ORF1基因(939 bp)克隆入pMD18-T载体,将筛选获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。测序分析表明,克隆的ORF1与广东分离株DQ659154的核苷酸序列同源性高达99.6%,推导的氨基酸序列同源性为99.4%。将ORF1双酶切产物插入原核表达载体pET-41a,得到的重组子命名为pET-ORF1。用IPTG进行诱导表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,PCV1ORF1在pET-41a中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为67.6 ku。