信号肽对O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中表达及分泌的影响

构建融合不同信号肽的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白真核表达载体,筛选不同的分泌型信号肽以提高O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)中的表达并使其分泌到CHO培养基中。通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5′端相连,分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western-blot检测CHO培养基中重组表位蛋白累积量,研究结果表明,O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中成功分泌表达,不同的分泌型信号肽明显改变O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO培养基中的累积SCGB1D1 isoform信号肽介导的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达量最高。综上所述,合适的分泌型信号肽促进O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中的分泌。     

口蹄疫病毒亚单位与宿主细胞凋亡的研究进展

通过对口蹄疫病毒和其他小RNA病毒的蛋白质功能研究进行总结,分析了口蹄疫病毒蛋白参与调控宿主细胞凋亡平衡的作用,并对口蹄疫病毒持续感染形成的机制进行了探讨.     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A的研究进展

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一种最具影响、最难控制的动物疫病之一,严重危害着偶蹄动物的健康。FMDV属于单股正链RNA病毒,由结构蛋白和非结构蛋白组成。本文系统总结了口蹄疫病毒非结构蛋白3A的结构和功能特点,有助于进一步研究FMDV的感染机制并为FMD防控提供参考。     

口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定

为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。     

口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法的建立

为建立快速定量检测羊血清中口蹄疫病毒非结构蛋白抗体的方法,本研究通过优化抗原表达条件等步骤,在大肠杆菌原核表达系统中获得了可溶性的3A-3B1-3B2融合蛋白,基于纯化的可溶性融合蛋白建立了口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒。该方法能够检测羊血清中的口蹄疫病毒非结构蛋白抗体,敏感性高,特异性强,对其他相关的羊类病原无交叉反应,其组内与组间变异系数分别低于10%和15%,具有良好的重复性。对300份临床血清样品进行检测,同Procheck公司的口蹄疫非结构蛋白抗体试剂盒进行比较,阳性样品符合率为98%,阴性样品符合率为92%,总符合率为95%。重复性试验组内与组间变异系数均小于10%。口蹄疫病毒非结构蛋白抗体时间分辨荧光免疫分析检测方法同传统的ELISA方法相比,特异性相当、敏感性更高,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

应用紫外分光光度计对口蹄疫病毒纯化抗原的检测分析

应用紫外分光光度计对口蹄疫病毒纯化抗原的检测分析肖昭彭张强杨福荣（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）由ＲＮＡ和蛋白外壳组成，其中核酸占１／３，蛋白占２／３。ＦＭＤＶ经细胞培养后，有很多细胞蛋白及杂质，在理化分析、免疫化学...     

猪水泡病病毒的结构蛋白

文中比较了口蹄疫和猪水泡病病毒的物理化学特性,认为这两种病毒在结构上是不同的。将提纯的猪水泡病(SVD)和口蹄疫(FMD)病毒裂解并在聚丙烯酰胺凝胶中进行分析,发现在SVD病毒体以及空壳体中有分子量分别约为38000和3000道尔顿的两种多肽链存在。与FMD病毒相反,(在SVD病毒中)未发现可见量的空壳体解离的蛋白存在,(在FMD病毒中)这种蛋白能产生可测出量的缩短的多肽,它可能与病毒的RNA相关联。     

口蹄疫病毒结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位的预测

以口蹄疫病毒OLZ0 2株基因组序列为材料 ,采用Garnier Robson法、Chou Fasman法和Karplus Schulz法预测了其结构蛋白的二级结构 ,用Kyte Doolittle法分析了各结构蛋白的亲水性 ,Emini法预测了各结构蛋白的表面可能性 ,Jameson Wolf法预测了各蛋白的抗原指数 ,综合评价了口蹄疫病毒结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明 ,VP1蛋白含有的B细胞优势抗原表位最多 ,是研制口蹄疫基因工程疫苗的首选免疫原 ,但其他结构蛋白也含有少量的B细胞抗原表位 ,有的甚至有可能成为优势抗原表位     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因的克隆及表达

从亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒中提取总RNA,采用反转录聚合酶链反应获得了长度约为700bp的核苷酸片段,大小与预期长度相符。扩增产物经克隆测序,证明其为VP1基因。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX 4T 1,成功构建了重组表达质粒pGEX VP1;利用IPTG诱导,表达出了53ku的目的蛋白条带。Western blotting分析表明,表达产物能与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒抗血清特异性结合。亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒结构蛋白VP1在大肠埃希氏菌中表达成功。     

小RNA病毒蛋白的系统命名法——L_(434)法则

小RNA病毒(Picornavirus)蛋白是根据病毒在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上的电泳图谱而命名(Summers et al,1965)。这种方法不仅在不同病毒中相应病毒蛋白产生出不同的名称,如病毒聚合酶在脊髓灰质炎(Polio)病毒、口蹄疫病毒(FMDV)和脑心肌炎(EMC)病毒中分别被称     

Asia 1型口蹄疫病毒多表位基因的原核表达及ELISA 检测方法的建立

根据国内流行的Asia 1型口蹄疫病毒的基因组特性,合成了Asia 1型口蹄疫病毒2个流行毒株VP1基因的5个抗原表位,并将其克隆到pMDl8-T载体上,再按设计的酶切位点连接,构建出Asia 1型口蹄疫病毒VP1双拷贝基因片段(VPlAsia).然后,将VP1Asia基因连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了重组表达质粒pET-28a-VPlAsia,接着将其转入BL21茵中进行原核表达.以纯化的表达蛋白作为抗原检测了牛Asia 1型口蹄疫病毒阳性血清.结果显示,VPIAsia基因在大肠杆菌中获得了高效表达,以纯化的VPIAsia蛋白作为抗原建立了检测Asia 1型口蹄疫病毒抗体的ELISA方法.以建立的ELISA方法和标准Asia 1型口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒对30份临床样品进行了检测,两种检测方法的阳性率分别为90.0% (27/30)和93.3%(28/30),符合率为89.7%(26/29).本研究为组装Asia 1型口蹄疫病毒抗体ELISA诊断试剂盒奠定了基础.     

口蹄疫病毒组织培养的研究——仔猪肾上皮细胞分离培养口蹄疫O型及ZB型病毒

口蹄疫病毒曾是最早能在组织上培养的病毒之一。 近年来很多国外学者Bachrach氏,Sellers氏,Dinter氏,CeprNeeB氏,MuTeB氏等人都先后成功的在犊牛、仔猪、羔羊肾细胞组织培养上培养了口蹄疫病毒,并描述了病毒生长及引起致细胞病变情况。 国外都先后应用犊牛、仔猪肾细胞组织培养制造口蹄疫病毒疫苗,并已广泛应用于生产实践。     

Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了获得Asia1型口蹄疫病毒非结构蛋白3B的单克隆抗体,以含Asia1型FMDV/JS/05毒株3B基因的pCAGGS-3B质粒为模板,扩增3B蛋白基因,并克隆至pET-30a(+)载体,进行原核表达及纯化。分别以Asia1型口蹄疫病毒、纯化的3B蛋白为抗原,免疫4~6周龄的雌性BALB/c小鼠,经过4次免疫后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5∶1~10∶1进行细胞融合,用本实验室建立的间接ELISA对融合后的细胞进行筛选,并进行4次有限稀释筛选出的阳性细胞扩大培养后,注射小鼠腹腔,制备腹水。对制备的腹水进行类别鉴定、反应原性和效价鉴定。结果表明,获得1株能稳定分泌抗Asia1型口蹄疫病毒3B蛋白的细胞株,其抗体类别为IgM,腹水效价为1∶12 800,通过Western-blot和间接免疫荧光试验,确定其能识别口蹄疫病毒3B蛋白。     

Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒的构建及表达

为了构建Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒,采用多表位基因串联策略,合成包括口蹄疫病毒T细胞和B细胞表位基因的基因片段F,该基因片段由结构蛋白VP1上的2个B细胞表位(VP1135-159aa、VP1194-211aa)基因、非结构蛋白3A和3D上的T细胞表位(3A21-35aa、3D795-803aa)基因组成。利用限制性内切酶HindⅢ、XbaⅠ将基因片段F克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切鉴定、序列分析正确后,利用LipofectamineTM2000将阳性重组质粒pc-F转染至BHK-21细胞。Western-blot和IFA分析结果显示,所表达的蛋白大小约25.4ku,能够与Asia 1型口蹄疫病毒标准兔抗血清发生特异性反应,证实所表达的蛋白具有较好的反应原性。结果表明,Asia 1型口蹄疫病毒多抗原表位真核表达质粒pc-F构建成功,且能在BHK-21细胞中正确表达。     

动物病毒的消毒

病毒对各种消毒药的抵抗力差异很大,同属病毒之间的差异一般小于不同属病毒相互之间的差异。在兽医上有重要性的主要病毒属的毒株都被选来进行本试验。口蹄疫、猪水泡病和鸡新城疫的病毒未选用,因为它们已列入1974年颁布的(已证实有消毒药)的动物疾病条例汇编(The provisions of the Diseases of Animals(Approved Disinfectants)Order,1974 ]中,口蹄疫病毒和猪水泡病病毒对一系列消毒药具有敏感性最近已有报道(Sellers,     

O型口蹄疫病毒致弱冷变种特性的研究

口蹄疫病毒同神经病毒及其它病毒均相类似,据此,很多研究者认为口蹄疫病毒在组织培养物中长期降低温度继代,其致病性将随之减弱。借助这种方法,成功地获得了口蹄疫病毒致弱变种。     

研制猪口蹄疫疫苗方面的进展

如所周知,用于免疫牛的口蹄疫福尔马林吸附疫苗在猪只能引起不满意的免疫性。在寻找一种更好的灭能苗的制造方法时,必须从以猪和病毒二者作为恒定的因素出发。口蹄疫病毒已经知道是一种构造相当简单的病毒,是由蛋白质和核糖核酸构成的,将病毒颗粒裂解成其亚单位后便不再有免疫力。因此只余下两种可变的因素,即灭能剂和佐剂。     

口蹄疫病毒感染动物组织及其产品传播口蹄疫的风险和控制

对影响口蹄疫病毒存活的因素、传播途径和最小感染量,口蹄疫感染动物不同组织、体液中口蹄疫病毒的带毒量和病毒存活能力,口蹄疫病毒在各类畜产品中的存活能力等相关研究进展进行了综述;对各类畜产品传播口蹄疫的风险进行了分析评估,并提出了风险控制措施和建议.     

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。     

口蹄疫流行毒株与疫苗毒株的生物学特性

口蹄疫是偶蹄动物的一种急性、高度接触性传染病。该病病原为口蹄疫病毒 ,属于小ＲＮＡ病毒科口蹄疫病毒属 ,包括Ａ、Ｏ、Ｃ、ＳＡＴⅠ、ＳＡＴⅡ、ＳＡＴⅢ ,ＡｓｉａⅠ 7个互不免疫的血清型 ,这7个血清型的口蹄疫病毒在长期感染动物的过程中 ,产生了许多变异毒株 ,目前已有 6 0余个亚型[1] 。本病传播途径多 ,传染性强 ,曾多次在一些国家或地区发生大流行 ,危害极大。 2 0世纪 80年代 ,口蹄疫在欧洲、南美洲、亚洲的许多国家暴发[2— 4 ] ,但其疫源众说纷云 ,难以定论。随着分子生物学技术的发展 ,从分子水平上追踪口蹄疫暴发的根源已成为…