猪瘟标记疫苗的研究进展

猪瘟 (Classicalswinefever ,CSF)是世界范围内猪的最严重的疾病之一 ,因而被OIE列为A类传染病 ,其病原为猪瘟病毒 (CSFV)。CSFV是黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属 (Pestivirus)中的 1个成员 ,属有囊膜的RNA病毒 ,基因组为单股正链RNA ,含有 1个大的开放性阅读框 (openreadingframe ,ORF) ,ORF两侧分别是 5′ 非翻译区 (5′ UTR)和3′ 非翻译区 (3′ UTR)。CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码 ,翻译成 1个含 3898个氨基酸的多聚前体蛋白 ,这一大型前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋…     

猪水泡病病毒结构蛋白编码区核苷酸的序列测定与分析

以猪水泡病病毒 (Swinevesiculardiseasevirus ,SVDV)HK’70为材料 ,用特异性引物扩增出P1区的 2个重叠目的片段 ,连接于pMD 18 T载体 ,转化JM 10 9感受态细胞。经重组质粒的双酶切 ,PCR鉴定后测序。序列分析表明 ,HK’70P1区核苷酸组成中A含量较高 ,G C含量较低 ,且A G、C T转换率较高。P1序列同源性分析表明 ,SVDVHK’70与J1’73、H/3’76、SVDV(Seechurn等测株 )、NET/1/92的核苷酸序列同源性分别为 97.8%、98.1%、97.6 %和 89.3% ;相应地 ,推导的氨基酸序列同源性分别为 98.8%、98.7%、98.8%和 96 .5 %。     

复方中草药对隐性乳房炎乳牛细胞免疫功能的影响

选用当归、川芎、芍药、黄芪、蒲公英、丹参、益母草等中草药,配制成饲料添加剂饲喂患隐性乳房炎乳牛,检测乳牛淋巴细胞刺激指数(SI)和中性粒细胞吞噬力的变化,并用北京亚临床乳房炎快速诊断液(BMT)对供试牛进行疗效跟踪检验.结果表明,该中草药添加剂可显著提高SI(P＜0.05)和中性粒细胞吞噬力(P＜0.05),并能明显降低乳牛隐性乳房炎的发病率.     

口蹄疫病毒VP1蛋白诱导犊牛甲状腺初代细胞凋亡的鉴定

为了制备和培养犊牛甲状腺初代细胞(CTY),并检测口蹄疫病毒VP1蛋白对其诱导的凋亡情况,采用原代细胞培养方法,取初生犊牛甲状腺制备初代细胞并培养。采用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,再用限制性内切酶EcoRⅠ+XhoⅠ酶切后定向克隆到表达载体pCAGGS中,构建重组质粒pCAGGS-VP1,转染CTY,用Western-blot检测口蹄疫病毒VP1蛋白在犊牛甲状腺初代细胞中的表达情况;通过显微镜观察转染的CTY细胞状态、经AV-PI双染色、检测线粒体膜电位变化和Hoechst-33258荧光染色来检测细胞凋亡。结果显示,成功制备了犊牛甲状腺初代细胞,构建的重组质粒可以在犊牛甲状腺初代细胞中表达,通过几种方法均证明口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导犊牛甲状腺初代细胞的凋亡,细胞凋亡率比空载体对照组高约2倍。结果表明,口蹄疫病毒VP1蛋白能够诱导CTY的凋亡,这一结果为深入研究口蹄疫病毒VP1蛋白凋亡功能域和VP1诱导的凋亡途径奠定了基础。     

猪生殖与呼吸综合征病毒多基因重组真核表达质粒的构建及诱导的小鼠体液免疫

根据猪生殖与呼吸综合征病毒已知序列设计了3对引物,采用RT-PCR方法分别扩增ORF3、ORF5和ORF6基因,并将其依次与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-ORF6-ORF3-ORF5,经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射,每只100ìg,2周后再注射1次.首免后每隔7 d采血1次,用间接ELISA检测血清抗体水平并测定其中和抗体水平.结果显示,所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生很高的ELlSA抗体和中和抗体水平.     

双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用

简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。     

猪瘟病毒囊膜蛋白基因pcDNA4.0-E重组质粒的构建及其对小鼠的免疫原性

以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR方法,克隆得到猪瘟病毒囊膜蛋白E0-E2cDNA全序列,并将其与真核表达质粒pcDNA4.0定向连接,构建了重组质粒pcDNA4.0-E。经提纯后,给试验组小鼠后肢胫前肌注射pcDNA4.0-E,每只100μg,15 d后再注射1次,同时设空白对照组。于二免后第10、203、0 d分别扑杀小鼠,进行免疫小鼠脾和外周血淋巴细胞的转化增殖试验,并用间接ELISA法检测血清抗体水平。结果显示,与空白对照组相比,所构建的重组质粒能够极显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞的增殖(P<0.01),血清抗体水平从二免后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于对照组(P<0.01)。说明该重组质粒能够诱导小鼠产生特异性免疫反应。     

瘟病毒非结构蛋白的结构和功能

猪瘟病毒 (CSFV)、牛病毒性腹泻病毒 (BVDV )和边界病病毒 (BDV)均为黄病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒属 (Pestivirus)的成员[1] 。它们在结构、抗原性和遗传上关系密切。据推测CSFV、BVDV和BDV是由一个共同的祖先为适应不同动物演变而来。BVDV和BDV可感染反刍动物和猪 ,CSFV仅感染猪。瘟病毒属成员均为小的、有囊膜的、单股正链RNA病毒。病毒基因组长约 12 .312 .5kb。CSFV基因组为单股正链RNA ,长约 12 .3kb ,包括一个 5′非翻译区 (5′UTR) ,一个编码 4种结构蛋白 (C、Erns、E1和E2 )和 8种非结构蛋白 (Npro、p7、NS…     

基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用

本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体p ET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性。PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 g,血清以1∶200倍稀释,作用1.0 h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用1 h,TMB显色时间为25 min。在该优化条件下,D4500.269为阳性,反之为阴性。特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9%。重复性试验表明,批内变异系数0.99%~2.33%,批间变异系数3.54%~6.67%。用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7%,与标准试剂盒的符合率为95.1%。总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测。     

动物RNA病毒全长感染性cDNA的研究进展

动物致病性RNA病毒,如登革热病毒(DEN)、猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV )、口蹄疫病毒(FMDV)和风疹病毒(RUBV)等,可诱发人或动物产生严重的传染病。这些传染病在世界各地的间歇性暴发,给人类健康造成了严重影响,给畜牧业发展造成了巨大的损失。逆向遗传学的发展有力地推动了动物RNA病毒的研究,它的基本内容包括通过RT PCR获得RNA病毒的全长cDNA分子,对该cDNA进行一定的基因工程操作后,利用体外转录等方法再将其转变为RNA ,然后用改造后的病毒RNA转染适宜的宿主细胞,进行病毒分子生物学研究。该技术已成为研究动…