登革病毒SYBR Green Ⅰ real-time PCR方法的建立及应用

为建立灵敏、高效的登革病毒检测方法,本试验拟以包含登革病毒3′端保守序列的质粒pUC57-DENV为模板,建立检测DENV的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在4.88×10~1～4.88×10~9copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.653。最低检测限度为4.88 copies/μL,对照组未出现特异性扩增,所有稀释度的标准品在80.20℃出现特异性熔解峰。组内和组间试验的变异系数均小于1%。本试验建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法,可为登革病毒早期检测提供技术支持。     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立一种定量检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的实时荧光定量PCR方法,用RT-PCR扩增TGEV的M基因片段,构建含有TGEV M基因片段的重组质粒。用系列稀释后的重组质粒为模板,基于SYBR GreenⅠ来进行检测TGEV的实时荧光定量PCR扩增。结果显示,扩增效率为103.0%,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰,标准曲线具有优良的线性关系,最低可准确检测63copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%。用建立的PCR对3种常见猪源RNA病毒的检测结果均为阴性,对65份临床样品的检出率高于常规PCR。结果表明,建立了一种灵敏度高、特异性强、重复性好的检测TGEV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可用于TGEV的定量检测和猪传染性胃肠炎的早期快速诊断。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。     

坦布苏病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR,针对坦布苏病毒E基因设计1对特异性引物,用PCR扩增E基因后将其连接到pMD19-T载体上构建重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板绘制了SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,经反应条件优化后,绘制的SYBR GreenⅠ绝对荧光定量RT-PCR的标准曲线的线性关系显著(r20.999),平均试验间变异系数为0.26%;检测敏感性可达到2×101 copies/μL。应用该方法对人工感染坦布苏病毒的鸭组织进行的检测结果显示,从36份病料组织中检出35份为阳性,检出率为97%。结果表明,成功建立了检测坦布苏病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR,该方法较常规PCR更快捷、敏感、准确,适用于坦布苏病毒临床样品的检测。     

山羊关节炎脑炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109~1.19×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×10^1 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增。重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1%,重复性好。本研究首次建立了CAEVGag基因的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

猪德尔塔冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已公布的猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)N基因序列设计并合成特异的引物和TaqMan探针,构建质粒标准品,以标准品为模板建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了评价。结果显示,以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪库布病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和口蹄疫病毒为模板时均未检测到荧光信号,表明该方法具有良好的特异性;用2.66×10~6、2.66×10~5和2.66×10~4copies/L这3个不同浓度的质粒标准品进重复试验,循环阈值Ct的变异系数均低于2%,表明该方法具有良好的特异性;标准曲线斜率为-3.461,相关系数为R~2=0.998,表明阈值和模板浓度之间具有良好的线性关系。10倍梯度稀释质粒标准品,检测的最低限度为2.66×10~1 copies/L的质粒DNA,表明此方法具有良好的敏感性。利用该方法对194份临床猪粪便样品进行了检测,结果显示PDCoV阳性率为22.1%,明显高于常规RT-PCR的11.9%,表明该方法可应用于PDCoV的临床诊断及定量检测。     

鹅肾型星状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据鹅肾型星状病毒的ORF1b保守序列,设计出1对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的Ct值与标准质粒在2.42×10^4~2.42×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为24.2 copies/μL;该方法特异性强,对禽流感H9N2、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于2.5%。运用该方法对动物回归试验中攻毒的雏鹅的各脏器进行检测,结果显示,肾、脾和肝中病毒含量较高,其次是胰腺、肺及肠道,而心和脑中的病毒含量最低。上述结果表明,本研究成功建立了鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并根据此方法检测出该病毒对肾、脾及肝具有较强的亲嗜性,为该病原致病机制研究奠定了基础。     

猪附红细胞体实时荧光定量PCR检测方法的建立

参照猪附红细胞体16 S rRNA基因序列设计了1对引物,分别以标准株和分离株的基因组DNA为模板,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测猪附红细胞体,确定特异性产物的Tm值,同时做普通PCR。试验结果表明,特异性产物的Tm值为88.5℃,最低能检测到含0.036 fg/μL阳性质粒的标准品。以阳性质粒标准品10倍倍比稀释的模板进行实时荧光定量PCR,通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化,建立了检测猪附红细胞体的标准曲线。建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法显示了较好的特异性、敏感性和广谱性,为猪附红细胞体病的临床检测和流行情况调查提供了新的技术手段。     

禽源致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立定量检测禽致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR GreenⅠqPCR方法,设计特异性引物,用PCR扩增irp2基因片段,克隆至载体p MD18-T,转化DH5α细胞,提取阳性重组质粒。以重组质粒为标准模板,建立定量检测irp2基因的特异性荧光定量PCR方法,进行特异性、灵敏度、重复性等性能评价,并对临床分离的187份疑似禽致病性大肠杆菌进行irp2基因定量检测。结果显示,PCR扩增片段的大小为261 bp,与Gen Bank中已知基因序列的同源性为100%,建立的qPCR方法 Ct值与标准品模板在4.1×100~2.3×1010copies/L范围内呈良好的线性关系,扩增曲线呈"S"形,相关系数为0.978,斜率为-3.286。该方法与副鸡嗜血杆菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)无交叉反应,灵敏度达到2.3×100copies/L,比常规PCR高1 000倍,重复性变异系数小于4.00%。使用建立的irp2 qPCR对采集的疑似禽致病性大肠杆菌病料进行荧光定量PCR检测,阳性检出率为36.4%,显著高于普通PCR检测率。结果表明,建立了禽源大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,该方法适用于含HPI+毒力岛致病性大肠杆菌的快速筛选、毒力基因及其转录水平的定量检测,可为禽大肠杆菌病防控提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR Green I为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,并对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR Green I荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~(2)=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪δ冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度（1×10~(1) copies/μL）比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测牛细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,本研究通过提取牛细小病毒(ATCC VR-767)核酸,扩增NS1基因片段(大小约为171 bp),将NS1基因片段克隆到pMD19-T载体中,并将重组质粒p MD19-T-NS1/DH5α作为标准样品,用于建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,扩增基因片段长约171 bp,符合目的基因大小,经鉴定所构建的重组质粒正确。用该质粒测得SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的最低检测量为53.3 copies/uL。用该方法检测牛细小病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒和猪细小病毒,结果显示,只有牛细小病毒可以被检测到,而其他病毒均未被检出,表明该方法具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于1%,表明该方法具有良好的重复性。结果表明,本研究建立的基于NS1基因的牛细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性,可用于牛细小病毒感染的检测。     

牛共刺激分子CD80和CD86实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中牛CD80和CD86基因的序列,在保守区设计并合成各自的特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立一种检测牛共刺激分子CD80和CD86的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将CD80基因和CD86基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明,CD80基因、CD86基因和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102～1×108 copies/μL范围均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。证实,所建立的牛共刺激分子CD80和CD86荧光定量RT-PCR检测方法适用于临床样品的检测。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10~9~2.2×10~1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度(2.2×10~2、2.2×10~4、2.2×10~6copies/L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

PDCoV和PEAV二重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)是两种新发现的猪传染性冠状病毒,临床上均以腹泻症状为主,症状相似,临床上难以快速诊断。为建立一种快速、准确区分PDCoV和PEAV的二重RT-PCR方法,本研究根据PDCoV和PEAV N基因序列,分别设计2对特异性引物,以阳性质粒为模板,对二重RT-PCR反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性试验。结果显示,所建立的方法能够扩增出PDCoV和PEAV的特异性片段,大小分别为690 bp和208 bp,且对猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2)无扩增条带;对PDCoV和PEAV的最低检测量分别为5.13×102copies/μL、4.73×101copies/μL。对60份临床腹泻样本病料进行检测,结果PDCoV的检出率为21.6%,未检测出PEAV。本研究所建立的二重RT-PCR方法可用于临床流行病学监测,为快速诊断PDCoV和PEAV提供理论依据和技术支持。     

猪圆环病毒1型real-time PCR检测方法的建立

为了建立一种定量检测猪圆环病毒1型(PCV1)的实时荧光定量PCR方法,根据PCV1基因序列设计了1对特异性引物,并构建含有PCV1基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板建立了定量检测PCV1的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法,并绘制标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数为0.999,显示出优良的线性关系;最低可准确检测320copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%;该方法对PCV2、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪瘟病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法。结果表明,建立的real-time PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于PCV1的检测与定量分析。     

猪流行性腹泻病毒SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。