三个猪戊型肝炎病毒ORF2基因连续片段核酸疫苗的构建

为了研制猪戊型肝炎(HE)基因工程疫苗,设计引物扩增猪戊型肝炎病毒(HEV)的基因片段LB1、LB2、LB3,分别与真核表达载体pEASY-M1Expression Vector直接进行T-A连接,构建得到了重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3。将这3个重组真核表达质粒分别转染293T细胞,采用实时荧光定量RT-PCR检测目的基因,并进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定。结果显示,重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3在转染的293T细胞中均可表达一约20.5ku的目的蛋白,且具有良好的HEV抗原性。本试验获得的3个HEV ORF2连续片段的候选核酸疫苗为今后进一步研制HEV核酸疫苗奠定了基础。     

猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10~9~2.2×10~1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度(2.2×10~2、2.2×10~4、2.2×10~6copies/L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

猪戊型肝炎病毒广西株ORF2三段连续基因编码蛋白的表达及抗原性分析

为了确定猪戊型肝炎病毒(HEV)ORF2抗原性片段的分布,参考中国T1株序列设计套式引物,从新鲜猪粪中扩增出HEV部分基因片段,长1725bp,位于ORF2第205～1929bp之间,命名为HEVORF2-A。根据HEVORF2-A序列设计了3对引物,分别扩增HEVORF2-A三段连续的基因片段,命名为HEVORF2-B1、HEVORF2-B2、HEVORF2-B3,分别位于HEVORF2-A第1～576bp,577～1149bp,1150～1725bp之间。将这4段扩增的基因片段分别与表达载体pET32a(+)连接,并转入BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析。结果显示,经1mmol/LIPTG37℃诱导6h后,除pET32a-A在82.6ku处有微量融合蛋白表达外,pET32a-B1、pET32a-B2、pET32a-B3分别在41.3ku、41.5ku、41.8ku处有高水平的融合蛋白表达。用自然感染猪血清和北京万泰HEVELISA诊断试剂盒阳性对照血清进行Western-blot分析,结果3个短的融合蛋白均能检测到明显的条带,表明构建的3个表达载体具有良好的抗原性。