重组狮头鹅α干扰素的制备及其抗病毒活性

用PCR方法扩增了狮头鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,并克隆至pET-32a(+)表达载体,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组狮头鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子质量大小约36ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。rGoIFN-α包涵体经过变性、超滤纯化和复性,得到可溶性rGoIFN-α。rGoIFN-α经肠激酶酶切(eGoIFN-α)、亲和纯化获得狮头鹅α干扰素蛋白(GoIFN-α)。rGoIFN-α经Western-blot检测证实是GoIFN-α蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析α干扰素的抗病毒活性,复性后纯化的rGoIFN-α的抗病毒活性达1.42×104U/mg;eGoIFN-α的抗病毒活性达8.23×104U/mg,GoIFN-α抗病毒活性达3.34×105U/mg。结果表明,rGoIFN-α能够抑制新城疫病毒Roakin株在鸡胚成纤维细胞中复制。     

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。     

恒河猴干扰素-γ基因的原核表达及其免疫活性的初步研究

为构建以恒河猴干扰素-γ为目的基因的原核表达重组质粒并进行免疫活性分析,获得具有生物学活性重组IFN-γ蛋白。应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从恒河猴外周血单个核细胞(PBM C)扩增干扰素-γ基因,然后将其克隆至表达载体p ET32a(+)中,转化BL21(D E3)进行诱导表达。SDS-PAG E电泳分析其可溶性,W estern-blot检测纯化后的重组蛋白,采用淋巴细胞增殖试验检测重组IFN-γ的活性。结果显示,成功构建恒河猴干扰素-γ原核表达重组菌,重组蛋白分子质量约为35.4 ku,主要以包涵体形式存在。重组IFN-γ具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性。结果表明,本试验成功获得了重组IFN-γ蛋白,表达量高且具有生物学活性,为重组IFN-γ治疗恒河猴疾病奠定了基础。     

利用杆状病毒表达系统表达猪IFN-L3及其抗PEDV活性的研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞上表达重组猪干扰素L3(rPoIFN-L3)进行抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究。首先通过间接免疫荧光和Western-blot验证rPoIFN-L3表达,并用Protein A亲和层析柱进行蛋白纯化;采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV~*GFP)检测rPoIFN-L3的抗病毒活性,含rPoIFN-L3的细胞上清的抗病毒活性为1×10~3AU/mL,纯化的rPoIFN-L3抗病毒活性为5×10~5AU/mg。进一步对纯化的rPoIFN-L3蛋白在IPEC-J2细胞上进行抗PEDV活性探究,结果显示,rPoIFN-L3可呈剂量依赖性抑制PEDV复制,并且上调相关干扰素-刺激基因(ISGs)的表达。由此证明,本研究表达的rPoIFN-L3具有抗病毒活性,并可有效抑制PEDV在IPEC-J2上的复制,对预防和治疗PEDV感染有重要意义。     

鸭γ干扰素在体外细胞中抗鸭肠炎病毒作用的研究

为初步探究鸭γ干扰素(IFNγ)抗病毒作用,本研究从鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast,DEF)中扩增出鸭γ干扰素(IFNγ) cDNA。将鸭IFNγ基因分别与真核表达载体PCAGG及原核表达载体p ET-32a连接,获得重组质粒PCAGG-IFNγ及pET-32a-IFNγ。转染PCAGG-IFNγ于DEF细胞后第24小时,接种鸭肠炎病毒(duck enteritis virus,DEV)。同时将pET-32a-IFNγ在大肠杆菌原核表达系统中进行蛋白表达,并用纯化产物处理DEF细胞,处理后第24小时接种DEV,分别采用Western-blot、TCID50测定方法和荧光定量PCR检测重组蛋白IFNγ对DEV复制的影响,并检测细胞中相关干扰素刺激因子(interferonstimulated genes,ISGs)基因包括抗黏液病毒基因(Myxovirus resistance,Mx)、泛素样2′-5′寡聚腺苷酸合成酶基因(2′-5′oligoadenylatesynthetases-like,OASL)、DEAD框蛋白50基因(DEAD-box protein 50,DDX50)的表达情况。结果发现,无论是真核表达的还是原核表达的重组IFNγ均能抑制DEV的复制,并引起ISGs基因表达的上调。本研究结果为进一步探索鸭IFNγ的抗病毒机制提供了基础数据。     

扬子鳄α型干扰素蛋白抗病毒活性分析

为了研究扬子鳄IFN-α抗病毒活性,构建真核表达载体pcDNA3.1-caIFN及pEGFP-N1-caIFN,将pc DNA3.1-caIFN转染至293T细胞中,通过间接免疫荧光试验证明IFN-α成功表达,并显示定位于细胞质中,第48小时扬子鳄IFN-α的表达量要高于第24小时的。将pEGFP-N1-caIFN转染至Vero细胞中,过表达24 h后接种水疱性口炎病毒(VSV),观察细胞,并在VSV感染后第24及48小时收集细胞,通过荧光定量PCR测定病毒VSV-G基因的变化,同时收集上清测定VSV子代病毒滴度,结果表明,与对照组相比,第24及48小时过表达扬子鳄IFN-α的试验组VSV-G基因的表达分别下调4倍及7倍,VSV子代病毒滴度分别低2.3及1.9个数量级。本研究结果证明,真核表达扬子鳄IFN-α蛋白能够抑制VSV mRNA的转录,并能抑制病毒增殖。     

稳定干扰IFITM1表达的细胞系建立及对PRV、PCV2、TGEV在细胞内复制的影响

为构建稳定干扰(IFITM1)基因表达的猪空肠上皮细胞系J2-KD(knockdown,KD),并研究干扰IFITM1表达后对伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染的影响。应用基因克隆技术,构建pLKO.1-EGFP-Puro-IFITM1重组载体,与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,产生绿色荧光蛋白标记的表达IFITMshRNA的慢病毒,48 h后收集病毒上清。用收获的慢病毒感染猪小肠上皮细胞(J2细胞)后,经过嘌呤霉素筛选及细胞有限稀释法,通过RT-PCR鉴定后,获得稳定干扰IFITM1基因的细胞系,并由MTT法验证干扰IFITM1表达对J2细胞生长无影响,将成功构建的干扰IFITM1表达的J2稳定细胞系命名为J2-KD。分别用PCV2、PRV和TGEV感染J2-KD细胞,用实时荧光定量PCR方法检测病毒的复制情况。结果显示,成功建立了稳定干扰IFITM1表达的J2细胞系(J2-KD);在J2-KD细胞中PCV2和TGEV病毒复制拷贝数出现升高,而PRV出现降低的现象。表明,干扰IFITM1基因明显抑制PRV病毒复制,而促进TGEV和PCV2的复制,这为进一步研究猪源IFITM1蛋白功能及阐明其抗病毒分子机制奠定了基础。     

鸡α干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性的测定

将克隆的鸡α干扰素(ChIFNα)基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNα,线性化后电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1%甲醇连续诱导4 d,SDS-PAGE检测结果表明鸡α干扰素在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为18 ku。细胞病变抑制法检测其效价为1×10~(7.69)U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。针对Ⅰ群4型禽腺病毒YBAV-4株强毒的动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白具有较好的抗病毒活性。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白对Ⅰ型干扰素产生的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)结构蛋白M对Ⅰ型干扰素(IFN)产生及其信号通路的影响,将PEDV M蛋白表达质粒转染HeLa细胞后用poly (I:C)刺激,应用双荧光素酶分析系统对IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN-β、IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56转录水平进行检测,应用Western-blot对IRF3磷酸化及CREB结合蛋白(CBP)表达进行检测,应用IFA试验对IRF3核移位及CBP蛋白表达进行检测。结果显示,M蛋白过表达细胞内IFN-β-Luc、IRF3-Luc表达水平显著下调,IFN-β、ISG15、ISG56转录水平显著下降,TRAF3、TBK1、IKKε、IRF3蛋白过表达细胞内的IFN-β-Luc表达水平显著降低,但IRF3的磷酸化、核移位以及CBP的表达不受影响。结果表明,PEDV M蛋白可以通过对IRF3信号通路的影响来抑制Ⅰ型IFN的产生。     

猪IFN-α1基因的原核表达及其蛋白质结构的预测

利用RT-PCR技术,从被诱导的猪外周血单核细胞中克隆出了猪α1干扰素(IFN-α1)基因.序列分析表明,克隆的猪IFN-α1基因序列与GenBank上登录的猪IFN-α1基因的同源性为97.8%.用克隆的猪IFN-α1基因构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-IFN-α1.探讨了猪IFN-α1.基因表达的最佳条件,并在大肠杆菌中对此基因进行了表达.结果表明,IPTG的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L,最适诱导温度为42℃,诱导9h表达量最大,表达产物约占菌体总蛋白的30%.SDS-PAGE分析表明,表达产物的分子质量为45 ku,且目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经预测,猪IFN-α1蛋白为一结构松散的球状蛋白.     

内含肽和麦芽糖结合蛋白介导具有抗病毒活性牛α干扰素的表达

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素(BoIFN-α)蛋白,在BoIFN-α基因的上游无缝连接内含肽Ssp DnaB intein(SDI)序列,然后克隆至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的表达载体pMAL-SDI-BoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,且产物主要以可溶形式存在。经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经MDBK-BVDV(牛病毒性腹泻病毒)干扰素活性系统检测,证实干扰素融合蛋白具有抗病毒活性。     

比格犬α7干扰素成熟肽基因的原核表达及表达产物活性的分析

从比格犬的脾中提取基因组DNA,采用RT-PCR方法扩增比格犬α7干扰素成熟肽基因。将纯化的PCR产物克隆至pMD19-T载体,转化入感受态细胞DH5α中,PCR检测及测序鉴定结果表明,克隆的目的基因为比格犬α7干扰素成熟肽,与GenBank中登录的犬干扰素序列(NM001006654)的同源性达到100%。在此基础上构建重组原核表达质粒pET-32a-CaIFN-α7,并转化至表达宿主BL21(DE3)中。该工程菌在37℃经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约38.4ku处出现了目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经Bandscan软件分析,表达产物约占菌体总蛋白的48.5%。用Protein Refolding Kit对包涵体进行纯化复性,重组CaIFN-α7在犬肾细胞(MDCK)上具有较高的抗病毒活性。     

鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK和鸡IFN-γ重组质粒的构建与体外表达

采用SOE-PCR技术将鸡柔嫩艾美耳球虫CDPK抗原基因与鸡干扰素-γ(IFN-γ)基因用(GGGGS)315个疏水柔性氨基酸接头融合,扩增出IFN-γ-CDPK融合基因,将其克隆到pMAL-p2X载体上,构建了重组原核表达质粒pMAL-IFN-γ-CDPK,用IPTG诱导表达并纯化重组蛋白,经免疫印迹分析该蛋白的生物学活性。结果显示,成功构建了共表达IFN-γ-CDPK融合基因的原核表达载体,表达纯化了具有良好的免疫反应性的IFN-γ-CDPK融合蛋白,表达纯化的IFN-γ-CDPK融合蛋白能够和鸡柔嫩艾美耳球虫甘肃株抗血清发生特异性结合,为进一步研制高效力的鸡球虫新型基因工程疫苗奠定了基础。     

猪源牛病毒性腹泻病毒1型分离株的鉴定及培养特性研究

利用RT-PCR方法从猪场腹泻样品中检测到牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核酸阳性样品,测序证实为1型BVDV,命名为SHCM06。遗传进化分析表明,其与ZM-95亲缘性最近,同源性达98.3%;与BVDV-1经典毒株亲缘性较远,仅85.7%~89.8%。免疫荧光、Western-blot和荧光定量RT-PCR检测均表明,SHCM06毒株可感染MDBK、ST和PK15细胞,在MDBK和ST细胞上的增殖效率显著高于PK15细胞。进一步分析SHCM06感染对细胞中Ⅰ型干扰素表达的影响,结果显示,SHCM06感染均能使3种细胞中IFN-α和IFN-β表达量显著下降(P0.05),且对MDBK细胞IFN-α的抑制效果显著高于对PK15细胞中IFN-α的抑制作用(P0.05)。结果表明,从猪临床腹泻样品中分离1株BVDV1型,该病毒对MDBK、ST细胞适应性好于PK-15细胞,能显著抑制细胞中Ⅰ型IFN的产生,以发挥抵抗细胞抗病毒免疫效应,本试验为深入研究猪源BVDV的致病作用奠定了基础。     

猪IFN-γ基因的融合表达及其表达产物的生物学特性

依照猪IFN-γ(pIFN-γ)成熟蛋白基因序列设计引物,将已扩增的pIFN-γ基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建了GST-pIFN-γ融合表达载体,该载体转化宿主菌BL21后用IPTG进行诱导表达并对诱导表达条件进行了筛选和优化,筛选出最佳诱导表达条件后大量诱导表达,可溶性的表达产物经GST琼脂糖凝胶亲和纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化.经SDS-PAGE和Western-blot分析,证实得到了高纯度的融合蛋白,该蛋白的分子质量为42ku.选择FMDV和PRV两种不同的病毒(RNA病毒和DNA病毒)进行GST-pIFN-γ抗病毒活性测定.结果表明,GST-pIFN-γ融合蛋白可有效抑制这两种病毒引起的细胞病变,其对FMDV的抑制作用远远大于对PRV的抑制.对GST-pIFN-γ融合蛋白的稳定性及机体毒副作用的研究表明,该pIFN-γ的稳定性有较大提高,而毒副作用大大降低.     

牦牛IFN-γ基因的表达及其产物的生物学活性分析

用植物血凝素和脂多糖诱导牦牛外周血淋巴细胞,提取细胞总RNA,利用RT-PCR技术克隆了牦牛IFN-γ(YakIFN-γ)基因,然后设计了1对表达引物,从pGEM-YakIFN-γ载体上扩增YakIFN-γ成熟蛋白基因,将牦牛IFN-γ基因与表达载体pET-30a连接,构建了重组表达质粒pET-30-YakIFN-γ。用IPTG诱导表达的可溶性表达产物经镍柱亲和纯化,用纯化的重组YakIFN-γ蛋白进行了MTT、抑制肿瘤细胞增殖和细胞病变抑制的生物学特性研究。结果显示,成功克隆和表达了YakIFN-γ基因;序列分析表明:克隆的YakIFN-γ基因序列与GenBank上登录的黄牛IFN-γ基因序列的同源性为99.0%。SDS-PAGE分析和Western-blot检测证实,获得了高纯度的重组YakIFN-γ蛋白。重组YakIFN-γ(rYakIFN-γ)对伪狂犬病病毒的活性单位为2.2×103U/mg。表明表达并纯化的rYakIFN-γ蛋白具有较高的生物学活性和干扰病毒复制的活性。     

牛IFN-α基因在食品级乳酸乳球菌中的表达及鉴定

本研究旨在构建能够表达牛α干扰素(IFN-α)基因的重组乳酸乳球菌。根据乳酸乳球菌密码子的偏好性对牛IFN-α的成熟肽编码基因序列进行了优化合成,得到IFN-α基因3′端添加6个组氨酸密码子的重组质粒pUC57-IFN-α,以此重组质粒为模板,通过PCR扩增得到上下游分别带有NcoⅠ和SpeⅠ酶切位点的目的片段,双酶切后与表达载体pNZ8149连接,连接产物转化乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞,得到的重组质粒通过PCR扩增、酶切鉴定分析以及测序分析表明,重组表达载体构建成功,将重组菌命名为NZ3900/pNZ8149-IFN-α。对重组菌使用nisin诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,可见在约20 ku处有明显差异性条带,Western-blotting检测其为特异性条带,间接免疫荧光检测重组菌有特异性荧光。本试验成功构建了重组表达载体pNZ8149-IFN-α,并使其在乳酸乳球菌中获得表达,这为牛IFN-α作为口服抗病毒药物和免疫增强剂的开发以及应用奠定了基础。     

犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达

为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。     

家兔γ干扰素基因的原核表达及其表达产物的单克隆抗体的制备

将PCR扩增的家兔γ干扰素基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体上,构建重组载体pET-28a(+)-IFN-γ。重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、HisTrap亲和柱纯化,获得IFN-γ重组蛋白。以IFN-γ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术获得4株抗IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3H8、4G4、4F10、6C12,它们的亚型分别为IgG1、κ链,IgG2b、κ链,IgG1、κ链,IgG1、κ链。分别制备单克隆抗体腹水,结果,4株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-4~10-5之间。本试验通过制备抗家兔IFN-γ单克隆抗体,为研究和检测IFN-γ提供了一种重要的工具。     

扬子鳄α型干扰素基因的克隆分析及表达量的测定

为研究扬子鳄IFN-α基因的序列、结构及生物学功能,对其进行了基因克隆、序列分析及表达量的测定。根据GenBank中登录的扬子鳄IFN-α基因序列(XM_006026085.1)设计合成特异性引物,通过RTPCR从成年扬子鳄外周血中扩增及克隆IFN-α基因CDS区,对其进行测序分析、进化树构建、同源性分析及结构和功能预测,并对扬子鳄不同组织中IFN-α的表达水平进行测定和分析。结果显示,扬子鳄IFN-α基因的完整ORF序列为672 bp,编码氨基酸223个,其中前26个氨基酸为信号肽。成熟蛋白的分子质量为26ku,等电点为9.51。三级结构预测显示该蛋白含有5段α螺旋,符合I型干扰素结构特征。同源性和进化树分析结果显示,扬子鳄IFN-α基因与密西西比鳄的同源性最高,在进化树中处于同一分支。IFN-α表达量在血液中最高,肌肉组织中表达量最低,非冬眠期的表达量高于冬眠期的表达量。上述研究结果为进一步研究扬子鳄IFN-α基因表达调控机制和基因功能奠定了基础。