羊口疮病毒ORFV129蛋白对树突状细胞成熟和功能的影响

为了探讨羊口疮病毒ORFV129蛋白对小鼠骨髓树突状细胞(DCs)生物免疫学功能的影响,从小鼠骨髓腔中分离获得单核细胞,诱导分化为未成熟DCs并用不同浓度的ORFV129蛋白进行刺激,采用流式细胞术检测成熟DCs的表面标记物MHC-Ⅱ、CD40等表达及吞噬FITC-dextran的能力,以及检测ORFV129蛋白作用DCs后分泌IFN-γ、IL-6等细胞因子的水平;采用CCK8法检测ORFV129蛋白对DCs刺激T细胞增殖的影响以及检测培养上清中IFN-γ、IL-5的水平。结果显示,经10μg与5μg浓度的ORFV129蛋白作用24 h后,DCs表面分子CD80、CD40的表达显著上调,与未处理组相比差异显著(P0.05);经ORFV129蛋白刺激后DCs吞噬FITC-dextran的能力下降;10μg的ORFV129蛋白极显著地促进了IFN-γ、IL-6、IL-12p40等细胞因子的表达,与空白组相比差异极显著(P0.01);另外,经ORFV129蛋白处理的DCs还可刺激T细胞增殖,以及使培养上清中IFN-γ的分泌量显著增加。ORFV129蛋白可上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD40、CD80和CD86分子表达,降低其吞噬能力,促进DCs分泌IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12p40等细胞因子,还可刺激T细胞增殖,表明ORFV129蛋白对DCs的成熟起到促进作用。     

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞活化CD8+T细胞的非蛋白酶体依赖途径

为研究树突状细胞加工和呈递灭活口蹄疫病毒(FMDV)抗原并活化CD8+T细胞的途径,用灭活FMDV负载经抑制剂预处理的小鼠单核细胞源树突状细胞(MoDCs),与CD8+T细胞共培养,对照为负载FMDV的正常MoDCs与CD8+T细胞.收集上清液,检测γ干扰素(IFN-γ)的含量.结果显示,试验组CD8+T细胞在共培养的...     

负载灭活口蹄疫病毒树突状细胞启动的CD4~+T细胞应答

为研究负载灭活口蹄疫病毒(iFMDV)树突状细胞对CD4+T细胞的活化效应,用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和白介素-4(rmIL-4)将小鼠外周血单核细胞诱导分化成树突状细胞(MoDCs),以信号阻断法制备淋巴结CD4+T细胞,利用负载iFMDV的MoDCs与CD4+T细胞共培养,以iFMDV+MoDCs作为对照,用ELISA检测不同时间培养上清液中IFN-γ的含量。用溶酶体抑制剂处理MoDCs,2h后再负载iFMDV,并与CD4+T细胞共培养,对照组则用iFMDV+MoDCs+CD4+T细胞,用ELISA检测不同时间培养上清液中IFN-γ的含量。结果显示,在共培养后第9和48小时,CD4+T细胞组与对照组比较差异均极显著(P<0.01)。共培养后第24和36小时,CD4+T细胞组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。溶酶体抑制剂处理后,共培养第9、24、36和48小时组与对照组比较,均有显著性差异(P<0.05)。这表明MoDCs可通过溶酶体-MHC-Ⅱ途径向CD4+T细胞提呈iFMDV抗原,并且活化的CD4+T细胞可分化成Th1细胞。     

旋毛虫ES抗原致小鼠骨髓源树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨旋毛虫排泄分泌(ES)抗原体外诱导小鼠骨髓来源的树突状细胞(DC2.4)在不同时间点对吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将ES抗原(终浓度为15?g/mL,试验组)、重组小鼠IFN-γ(浓度为1 000 U/mL,阳性对照组)和RPMI 1640培养液(阴性对照组)加入到状态良好的树突状细胞中,并设无添加的空白对照组,分别刺激0、2、6、12、24 h后收集细胞,采用细胞免疫组织化学方法检测各组树突状细胞IDO的表达情况,实时荧光定量法检测各组IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αmRNA表达水平,W estern-blot方法检测各组IDO蛋白表达水平。结果显示,ES抗原、IFN-γ均能提高IDO在细胞质中的mRNA及蛋白表达水平,且与空白对照组呈显著性差异(*P0.05,*P0.01,***P0.001);随着刺激时间的增加,IDO、IFN-γ、IL-10、TNF-αm RNA及IDO蛋白表达量均显著上升,且与空白对照组呈显著性差异(***P0.001)。结果证实,ES抗原可刺激树突状细胞表达IDO,且存在一定的时间效应,可能与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。     

鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响

采用鸡枞菌多糖(TAP)体外作用于小鼠T淋巴细胞,用ELISA法检测其IL-4、IFN-γ及IL-2水平,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测相关细胞因子mRNA表达量,观察研究了鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响。结果表明,与ConA组相比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进T细胞产生IL-4、IFN-γ及IL-2(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的T细胞CD4+%(P<0.01),升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。提示,TAP对细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。     

白花蛇舌草黄酮注射液对小鼠脾淋巴细胞的免疫增强作用

为探索自制白花蛇舌草黄酮注射液的免疫增强作用,测定了小鼠脾淋巴细胞的增殖情况,CD8+T细胞表面活化抗原CD69和CD25的表达以及细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的含量。结果显示,白花蛇舌草黄酮注射液在适当的浓度范围内能促进小鼠脾淋巴细胞增殖,促进CD8+T细胞活化以及细胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ的分泌。结果表明,自制的白花蛇舌草黄酮注射液具有免疫增强作用。     

日本血吸虫重组蛋白LHD-Sj23-GST诱导的细胞免疫应答和免疫保护效果

为探讨日本血吸虫重组蛋白LHD-Sj23-GST与3种不同类型佐剂(弗氏佐剂、ISA 206佐剂、ISA70M佐剂)配伍后免疫小鼠诱导的细胞免疫应答及免疫保护效果,应用流式细胞术检测并比较该重组蛋白配伍3种佐剂3次免疫后小鼠脾细胞中的CD4+、CD8+T细胞及细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10水平;3次免疫后小鼠人工攻击感染日本血吸虫尾蚴,6周后经肝门静脉灌注冲虫,计数各组平均虫体数并计算减虫率。与PBS对照组相比,LHD-Sj23-GST/FA和LHD-Sj23-GST/70M免疫组的CD4+T细胞显著升高(P<0.05),LHD-Sj23-GST/206免疫组未呈现明显变化;3种不同佐剂配伍LHD-Sj23-GST免疫组CD8+T细胞水平均显著降低(P<0.05);与PBS对照组相比,免疫组的IFN-γ及IL-10水平升高,而IL-4水平降低。LHD-Sj23-GST/FA、LHD-Sj23-GST/206和LHD-Sj23-GST/70M免疫组与PBS对照组相比,分别获得65.52%、51.72%和51.72%的减虫率;而相较于各自的佐剂对照组,则分别获得58.76%,26.31%,54.28%的减虫率。结果表明,用重组蛋白LHD-Sj23-GST配伍3种不同类型佐剂免疫小鼠,均刺激产生了偏向Th1型的细胞免疫应答,且都对小鼠诱导了较高的免疫保护作用。     

旋毛虫感染对小鼠脾树突状细胞吲哚胺2,3-双加氧酶表达的影响

为探讨小鼠感染旋毛虫后脾来源的树突状细胞在不同时间点吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)的表达情况,将一定量旋毛虫肌幼虫经口感染小鼠,感染剂量为每只300条肌幼虫,并设立对照组。分别在感染后第7、15、25、35、50天处死小鼠取脾,用免疫磁珠分选CD11c+树突状细胞,实时荧光定量PCR检测IDO、IL-10、IFN-γ和TNF-αm RNA的表达水平,Western-blot检测IDO的蛋白表达水平。小鼠感染旋毛虫后用1-甲基色氨酸(1-MT)按照200 mg/kg剂量灌胃,计算旋毛虫减虫率。实时荧光定量PCR结果显示,小鼠感染旋毛虫后IDO及相关因子的表达量均显著增加(*P0.05,**P0.01,***P0.001),IDO的表达量在感染后第25天达到峰值,IL-10的表达量在第15天达到峰值,而IFN-γ和TNF-α在第7天后均呈现下降趋势。Western-blot结果显示,IDO蛋白表达量趋势与IDO m RNA表达量趋势一致。用1-MT抑制IDO后,小鼠体内旋毛虫成虫和肌幼虫数量均明显降低(**P0.01,***P0.001),成虫减虫率为15.30%,肌幼虫减虫率为36.09%。结果证实旋毛虫感染后可刺激脾树突状细胞表达IDO,与旋毛虫逃避宿主的免疫有一定关系。     

保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23免疫特性的研究

为了解河北省保定地区奶牛源微小隐孢子虫子孢子表面抗原Cp23的免疫特性,将重组质粒p ET28-Cp23表达产物纯化后免疫4周龄BALB/c小鼠,进行细胞免疫水平和体液免疫水平的检测。结果显示,试验组的CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值和Ig G水平增加明显,IL-12及IFN-γ的质量浓度亦都增高,与对照组比较均有统计学意义(P0.01)。结果表明,用重组蛋白Cp23免疫小鼠后可产生高水平的体液免疫和细胞免疫。本研究为保定地区隐孢子虫病的预防提供了材料。     

表达禽流感病毒HA2-DEC205的减毒沙门菌DNA疫苗载体的构建与初步研究

构建表达H9N2亚型禽流感病毒HA2蛋白的延迟裂解型重组减毒沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-sec)和χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec),将其免疫小鼠,通过流式细胞术检测免疫细胞的变化。结果表明,沙门菌χ11218(pYA4545-HA2-DEC205-dimer-sec)能够提高CD3+CD4+T细胞分泌细胞因子IL-4、IFN-γ的水平。这说明重组沙门菌免疫小鼠能够激活机体的免疫系统,诱导发生一定的免疫反应。     

表面展示柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的侵入型乳酸菌的免疫特性研究

为了研究表达pgsA′-EtMIC2融合蛋白的侵入型乳酸菌的免疫特性,将pgsA′-EtMIC2基因片段插入到载体pSIP409-FnBPA中,得到pSIP409-FnBPA-pgsA′-EtMIC2重组质粒,并用电转化的方式转入植物乳杆菌NC8感受态细胞中,构建表面展示EtMIC2蛋白的侵入型乳酸菌。通过检测免疫雏鸡外周血淋巴细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞的发育情况,血清中EtMIC2抗体、IL-4、IL-18、IFN-γ的含量以及肠道灌洗液中IgA的分泌量来评价该侵入型乳酸菌对雏鸡的免疫特性。结果显示,成功构建出携带pSIP409-FnBPA-pgsA′-EtMIC2质粒的重组乳酸菌;雏鸡免疫后外周血淋巴细胞中CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+T淋巴细胞含量明显升高;EtMIC2抗体、IL-18、IFN-γ细胞因子及IgA产生的水平均显著上升,表明该侵入型乳酸菌具有一定的免疫效力,为后期研究抗球虫的免疫保护效果奠定了基础。     

黄芪颗粒对DON致BALB/c小鼠免疫损伤的保护作用

为探讨黄芪颗粒对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)致BALB/c小鼠免疫抑制的保护作用,将48只BALB/c小鼠随机均分为空白对照组、黄芪对照组、DON组和黄芪-DON组。黄芪对照组和黄芪-DON组提前1周在饮水中添加黄芪颗粒(0.02 g/mL),连续5周;DON组和黄芪-DON组灌喂DON 2.4 mg/(kg·d),连续28d。每天观察体质量、采食量、脏器系数、病理组织学、血液学指标等的变化;采用ELISA试剂盒测定血清IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β水平变化,用实时荧光定量PCR检测上述细胞因子基因mRNA的表达,并采用流式细胞术检测脾CD4~+、CD8~+、CD3~+、CD19~+T细胞。结果显示,黄芪-DON组的体增重、采食量和脾系数显著高于DON组(P0.05),肝系数、肾系数显著减小(P0.05);通过病理组织切片观察,发现黄芪-DON组肝、肾的病变程度明显低于DON组;黄芪-DON组CD4+/CD8~+、CD19~+和血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、TGF-β水平均显著高于DON组(P0.05),脾中IL-2、IFN-γ、TGF-β基因mRNA的表达量也显著高于DON组(P0.05)。结果表明,黄芪颗粒能明显减轻DON所致肝、肾损伤,缓减DON诱导的免疫抑制,可显著提升机体的免疫水平。     

吉氏巴贝斯虫人工感染对犬免疫功能的影响

通过静脉接种试验犬建立人工感染吉氏巴贝斯虫试验模型,利用MTT法检测外周血淋巴细胞(PMBC)的增殖能力,利用流式细胞术分析外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群的分布,利用Real-time PCR检测外周血中IL-6、IL-17、TNF-α、IFN-γmRNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,感染吉氏巴贝斯虫后犬PMBC的增殖能力显著下降(P0.05),外周血中CD3~+、CD4~+T淋巴细胞占比降低显著(P0.05),CD8~+T淋巴细胞占比下降不显著(P0.05)。与对照组犬相比,IL-6、TNF-α、IFN-γmRNA转录水平显著下调(P0.05)。结果表明,吉氏巴贝斯虫感染对犬免疫机能具有明显的抑制作用。     

小鼠抗日本血吸虫感染的脾早期细胞免疫应答的初步研究

以日本血吸虫尾蚴攻击感染C57BL/6小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、7、9、11、13天收集小鼠脾组织,检测分析早期感染阶段小鼠脾中重要炎症因子的表达动态变化,观察脾不同亚群免疫细胞的变化趋势,分析先天免疫分子在血吸虫感染宿主免疫应答进程中的作用。RT-q PCR结果表明,GZMA、GZMB、GZMK等颗粒酶,CCL2、CXCL10、CXCL11等趋化因子,IL-12a、IL-4、IL-6、IL-10等白细胞介素在感染后均不同程度上调表达;流式细胞术结果表明,小鼠感染日本血吸虫后CD3~+CD4~+T细胞和CD3~+CD8~+T细胞比值一直高于未感染对照组;同时NK细胞亚群比例在感染后第5天和7天明显增多。这些免疫相关细胞和分子的变化可能在小鼠抗血吸虫感染中发挥了重要作用。本研究为探究日本血吸虫感染的先天免疫机制等积累了实验数据。     

不同基因簇PCV2b安徽株对感染小鼠免疫应答的影响

为探讨同一基因亚型不同基因簇的猪圆环病毒2型安徽株[PCV2-DY0801(PCV2b-1A)、PCV2-BH0801(PCV2b-1B)、PCV2-XC0801(PCV2b-1C)]对感染小鼠免疫应答的影响,将16只SPF级昆明小鼠随机分为4组,分别接种PCV2-DY0801、PCV2-BH0801、PCV2-XC0801以及PBS,初次感染后第7、14、21和28天采集血液,进行IgG水平、T细胞亚群含量及Th1型和Th2型细胞因子水平的动态检测。结果显示,3株PCV2安徽株感染小鼠后均产生较高水平的IgG,被感染小鼠的外周血中CD4+、CD8+和CD4+CD8+T淋巴细胞的含量显著减少(P0.05),血清中IL-2、IL-4和IL-10的质量浓度显著升高(P0.05),其中BH0801组在初次感染后第14天CD4+含量显著低于XC0801组(P0.05),第21天IgG水平显著高于XC0801组(P0.05),第14、21天IL-2的质量浓度显著高于XC0801组、DY0801组(P0.05)。PCV2-BH0801诱导体液免疫反应最强,PCV2-XC0801诱导细胞免疫反应最强,而PCV2-DY0801均居中。结果表明,同一基因亚型不同基因簇的PCV2安徽株对感染小鼠的免疫应答有影响。     

十二指肠贾第虫γ贾第素和δ贾第素基因疫苗的构建及其免疫保护力的评价

为了评估贾第虫γ贾第素(γ-giardin)和δ贾第素(δ-giardin)的免疫原性及免疫保护力,构建了截短型真核表达质粒pcDNA3.1-γ-giardin、pcDNA3.1-δ-giardin和pcDNA3.1-γ-δ-giardin,并将这3种质粒肌肉注射到BALB/c小鼠体内,通过血清抗体测定、脾淋巴细胞增殖试验、淋巴细胞检测、细胞因子测定和攻虫试验评价疫苗的免疫保护力。结果显示,接种了这3种真核表达质粒的小鼠产生了特异性的体液和细胞反应,与对照组相比,Ig G和Ig G2a抗体水平显著提高,并且CD3~+CD4~+CD8~-和CD3~+CD8~+CD4~-T细胞百分比显著提高, pcDNA3.1-γ-giardin和pcDNA3.1-γ-δ-giardin免疫组的细胞因子IL-4和IFN-γ水平显著提高, pcDNA3.1-δ-giardin免疫组的IFN-γ水平显著提高。攻虫试验结果显示,接种pcDNA3.1-γ-giardin、pcDNA3.1-δ-giardin和pcDNA3.1-γ-δ-giardin基因疫苗的小鼠的减虫率分别为39.1%、26.1%和18.3%,单一DNA(γ-giardin或δ-giardin)质粒和多基因DNA(γ-δ-giardin)质粒均可以诱导小鼠产生一定的免疫保护力。     

桔梗皂苷D对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的研究

分析了桔梗皂苷D对小鼠脾淋巴细胞增殖、细胞因子IL-2和IL-4分泌、细胞膜表面标志和细胞周期的影响,进而探讨了桔梗皂苷D对小鼠脾淋巴细胞的免疫调节活性。小鼠脾淋巴细胞经桔梗皂苷D刺激后,M TT法检测桔梗皂苷D对脾淋巴细胞增殖的影响;ELISA法检测桔梗皂苷D对脾淋巴细胞分泌细胞因子IL-2和IL-4的影响;流式细胞术检测桔梗皂苷D对脾淋巴细胞膜表面标志和细胞周期的影响。结果表明,桔梗皂苷D能够提高脾淋巴细胞刺激指数,诱导脾淋巴细胞IL-2和IL-4的分泌,提高脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值、促进脾淋巴细胞从G 0/G1期进入S期。证实在一定质量浓度范围内,桔梗皂苷D可促进小鼠脾淋巴细胞增殖、诱导细胞因子分泌、提高CD4+/CD8+亚群比值、促进细胞进入DN A合成期,具有良好的免疫调节活性。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白DNA疫苗的研究

为构建含日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)完整ORF的核酸疫苗,评估该核酸疫苗在小鼠体内诱导抗血吸虫感染的免疫保护效果及其保护机制,将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中,用重组质粒pVAX1-SjGCP三次肌肉注射BALB/c小鼠,攻击感染血吸虫尾蚴,攻击感染后第42天剖杀小鼠冲虫,计算减虫率及肝和粪便的减卵率,评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测第3次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平,探讨核酸疫苗的免疫机制。结果显示,小鼠经pVAX1-SjGCP质粒免疫后诱导了31.9%的减虫率,以及47.85%、68.04%的肝减卵率和粪便减卵率,与PBS组差异显著;pVAX1-SjGCP免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加,细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高,与pVAX1组差异显著。结果表明,血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导宿主细胞免疫和体液免疫应答,产生Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在杆状病毒表达系统中的双表达

为了研制针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的新型疫苗,将IBDV的VP2基因和鸡IL-18成熟蛋白(mChIL-18)基因分别插入到双表达载体pFastBacDual的启动子P10和PH的下游,构建重组转移质粒pFastBacDual-VP2-IL-18。将其转座入大肠杆菌DH10Bac,获得了重组杆状病毒质粒,然后在昆虫细胞Sf9中双表达VP2-IL-18蛋白,并对双表达的VP2-IL-18进行生物学活性测定。结果显示,同一细胞中能分别表达出VP2蛋白和鸡IL-18蛋白,且表达的蛋白位于细胞胞质内。当VP2-IL-18的质量浓度为200ng/mL时能刺激鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ,IFN-γ的活性最高可达2.8×104 U/mL。当VP2-IL-18诱导产生的IFN-γ的浓度≥10U/mL时就能产生抑制水泡性口炎病毒的效果。结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18可以产生较强的生物学活性,为研制新型传染性法氏囊病IBD疫苗奠定了基础。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。