我国羊巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因的克隆与结构和遗传进化分析

用牛巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因序列BLAST我国羊感染的2种巴贝斯虫全基因组数据库,以获得的RON2基因保守序列片段为模板设计PCR引物;从6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增RON2基因全长序列,分析其基因结构特征;并通过序列比对和进化树构建,分析我国羊巴贝斯虫的遗传进化关系。结果显示,该基因无内含子,羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株(BspX J/DH)、莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株(BmTZ/LT)和莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株(BmNX/HB)RON2蛋白基因ORF的大小分别为4 029、4 047和4 044 bp,编码1 345、1 349和1 348个氨基酸。RON2蛋白的分子质量约为151 ku,等电点为8.91,具有3个跨膜区,N端第1～29位氨基酸为其信号肽区域。RON2核苷酸和氨基酸序列比对分析结果显示,BspXJ/DH与BmTZ/LT和BmNX/HB的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为67.0%～67.4%和69.2%～69.3%,BmTZ/LT和BmNX/HB间的相似性分别为92.8%～92.9%和91.1%～91.2%。系统发生树上羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫分别位于2大支,莫氏巴贝斯虫又被分为2小支。该结果为开展我国羊巴贝斯虫的分类关系和RON2基因功能的研究提供了基础数据。     

羊巴贝斯虫SBP3基因序列分析和诊断标识潜力评价

以GenBank中公布的巴贝斯虫球状体蛋白3(spherical body protein3,SBP3)基因序列为模板,设计合成特异性引物,从我国分离的6株羊巴贝斯虫基因组DNA和cDNA中扩增SBP3基因全长序列;利用生物信息学分析软件,进行基因序列比对、结构特征分析和遗传进化分析,以阐明我国羊巴贝斯虫SBP3基因特性和各虫株间的分类关系;以SBP3基因作为靶标基因,建立巢式PCR检测方法,评价其作为诊断标识基因的潜力。结果显示,羊巴贝斯虫SBP3基因无内含子,其中羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株、莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株和莫氏巴贝斯虫临潭株/天祝株的SBP3基因全长分别为3 195 bp、3 351 bp和3 348 bp;遗传进化分析结果显示,我国分离的6株羊巴贝斯虫可分为2个种,其中莫氏巴贝斯虫可能存在2个亚种;以SBP3为靶标分子建立的巢式PCR可特异性鉴别检测羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫,且与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊无浆体无交叉反应,检测羊巴贝斯虫未定种最低检测限为5 pg,检测莫氏巴贝斯虫最低检测限为0.5 pg。本试验将为进一步探究羊巴贝斯虫SBP3蛋白功能及羊巴贝斯虫流行病学调查提供数据和技术支持。     

莫氏巴贝斯虫trap基因的克隆表达及反应原性分析

本研究以莫氏巴贝斯虫临潭株为研究对象,分别从其基因组D N A和c DNA中成功扩增trap基因全长,应用生物信息学分析软件分析验证了该基因和蛋白的结构;构建p ET-30a-trap原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达;表达产物超声破碎后,对上清和沉淀进行SDS-PAG E分析。纯化可溶性的r Bm TRAP,W estern-blot分析其反应原性。结果显示,莫氏巴贝斯虫trap基因具有4个内含子和5个外显子,开放阅读框大小为2 100 bp。第1~23位氨基酸为信号肽序列,第45~201和第238~302位分别为TRAP蛋白家族的v WA和TSP1结构域;重组蛋白r Bm TRAP以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株阳性血清可特异性识别r Bm TRAP,而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株、羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、吕氏泰勒虫和羊无浆体阳性血清无交叉反应。结果表明,r Bm TRAP具有作为血清学诊断方法候选抗原的潜力,为将来建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株感染的免疫学诊断方法奠定了基础。     

我国十省份羊巴贝斯虫的分子流行病学调查

为了调查和分析羊的巴贝斯虫(莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种)在我国的分布情况,2010—2014年间,于我国10个省份共采集到823份绵羊和山羊血液样本,应用区分莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫未定种的实时荧光定量PCR方法,对提取的基因组DNA进行了检测。结果显示,除了海南省,其他省份都检测到莫氏巴贝斯虫的感染,总体阳性率为5.95%(49/823),其中河南省的阳性率最高,为10.47%(9/86);而羊巴贝斯虫未定种只在湖北、贵州和甘肃省检测到,阳性率分别为4.55%(2/44)、6.38%(3/47)和0.62%(2/322)。本研究首次应用实时荧光定量PCR对我国羊巴贝斯虫病的流行状况进行大范围的调查,为进一步了解我国羊巴贝斯虫的分布情况和制定羊巴贝斯虫病防控策略提供了可靠的分子流行病学信息。     

建立在PCR-RFLP方法基础上的羊梨形虫的种类鉴定

羊的梨形虫病在世界范围内广泛分布,由多种泰勒虫和巴贝斯虫引起。在我国主要有莫氏巴贝斯虫、羊巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫,给我国畜牧业造成了巨大的经济损失。为了快速准确地鉴定羊梨形虫,作者运用PCR技术扩增了梨形虫的18 S rRNA基因,然后再分别用内切酶ClaⅠ、Sau96Ⅰ和MboⅡ酶切扩增产物,根据酶切后限制性片段多态性的不同,建立了PCR-RFLP方法,达到了鉴定莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫的目的,为梨形虫的分类和流行病学调查提供了新的方法。     

双芽巴贝斯虫Hsp20一新基因型的发现及生物学特性分析

为了鉴定分离自甘肃永靖的1株双芽巴贝斯虫Hsp20基因型为一新基因型,参考双芽巴贝斯虫Hsp20核苷酸序列,设计特异性引物。对其进行扩增,利用生物信息学方法对其进行比对分析。结果显示,扩增获得了700 bp的核苷酸片段。与GenBank中公布的18种不同物种的氨基酸序列构建遗传发育树,结果表明本实验获得的双芽巴贝斯虫与美国株和中国新疆株的亲缘关系最近。对其氨基酸序列进行比对分析,发现在第31～85位点存在冗余,与公布的Hsp20氨基酸序列存在明显的差异。通过同源建模分析,发现该冗余致使Hsp20蛋白在第7号位形成1个环形结构,从而引起了第3号位的拉伸。通过生物信息学分析得出,获得的双芽巴贝斯虫甘肃株的Hsp20基因是一新基因型。该基因型的存在为更加准确诊断双芽巴贝斯虫病提供了依据。     

犬源韦氏巴贝斯虫的分子鉴定和系统发育研究

无菌采集疑似巴贝斯虫感染血样,进行全血基因组DNA的抽提,用保守引物5-22F和1661R进行巴贝斯虫18SrRNA基因的PCR扩增,扩增产物经克隆、测序后,获得大小为1 677bp的核苷酸序列。序列比对和系统发育分析发现,该序列与韦氏巴贝斯虫(AB083374)18SrRNA基因的相似性达100%,而与犬巴贝斯虫(AY072926)、罗氏巴贝斯虫(L19079)和吉氏巴贝斯虫(AF271081)18SrRNA基因的相似性分别为98.0%,95.2%和93.4%。从分子水平证实了韦氏巴贝斯虫在广东宠物犬的存在,同时也对巴贝斯虫的分类进行了讨论。     

羊源巴贝斯虫未定种甘肃敦煌株的发现

采用动物接种法将采自甘肃敦煌的15只绵羊血液混合后感染1只除脾绵羊,感染后逐日做血涂片检查。结果显示,在感染后第10天的血片上出现了1种大型巴贝斯虫。虫体形态以双梨子形、单梨子形、圆形及卵圆形为主。在感染后第12天,感染羊体温升至41.1℃。染虫率达到0.125%,之后逐渐下降。无菌采集该羊血液,提取全血基因组,用梨形虫通用引物进行PCR扩增全长18SrRNA基因,得到长约1 700bp的片段,将其克隆并测序(登录号:HQ730762),与GenBank中的其他巴贝斯虫的序列进行比较,发现其与新疆巴贝斯虫未定种的同源性最高,达到99.8%。本研究发现甘肃敦煌又是一个新疆羊巴贝斯虫未定种的疫源地。     

三株牛瑟氏泰勒虫P32表面蛋白基因的克隆与序列分析

为分析我国分离的3株牛瑟氏泰勒虫P32基因序列,根据GenBank上登录的牛瑟氏泰勒虫P32表面蛋白基因序列设计合成1对引物,用PCR方法分别扩增出牛瑟氏泰勒虫辽阳株、宁县株和汶川株的P32基因片段,并成功地将该基因纯化后克隆到pGEM-T Easy载体上,将经PCR鉴定和EcoR Ⅰ酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序.结果表明,克隆的这3株牛瑟氏泰勒虫P32基因片段长度均为875 bp,编码283个氨基酸.核苷酸同源性分析表明,该基因辽阳株与宁县株的同源性最高,为99.4%,汶川株与这2株的同源性分别是92.1%和91.9%,而我国辽阳株与日本株(AB016280)、俄罗斯株(AB016279)的同源性较高,分别为99.8%和99.6%.     

猪附红细胞体a1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体DnaK样蛋白HspA1编码基因a1的遗传变异规律,根据GenBank上登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列(登录号AM265536)设计合成1对引物,从上海市3个屠宰场采集自然感染猪附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA作为模板,进行a1基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,共获得了41条猪附红细胞体a1基因片段序列,序列长度均为1 657bp;同源性分析显示,它们与GenBank中登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列的相似性在97.7%~99.9%之间,氨基酸序列的相似性在99.1%~99.8%之间。系统进化分析表明,多数上海市猪附红细胞体分离株的a1基因与GenBank中登录的德国54/96分离株a1基因序列在同一个聚簇上。     

广西地区2004-2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF7基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子遗传进化情况,对2004-2010年间广西的PRRSV阳性病料进行了ORF5、ORF7基因扩增和序列分析。结果显示,所获得的毒株均属于美洲型毒株,其ORF5基因间的氨基酸序列同源性为89.6%～99.5%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为84.6%～91%、89.6%～95.5%和93%～99%,而与LV的同源性为54.7%～56.7%;ORF7基因间的氨基酸序列同源性为87.1%～99.2%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为91.1%～96%、91.9%～96%和89.5%～99.2%,而与LV的同源性为55.6%～58.1%。基于ORF5和ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树,可将所有PRRSV分离株分为4个亚群,广西地区的毒株分布在以CH-1a为代表的Ⅱ亚群、以HB-1为代表的Ⅲ亚群和以JXA1为代表的Ⅳ亚群,以Ⅳ亚群为主。表明当前广西PRRSV流行毒株以美洲型Ⅳ亚群为优势基因亚群,并且各毒株间的ORF5和ORF7基因序列存在一定差异,但没有明显的地域特征。     

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。     

双芽巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆表达及重组蛋白反应原性的研究

拟通过对双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(rhoptry-associated protein-1,RAP-1)羧基端进行研究,以期了解该蛋白的一些免疫学特性。利用生物信息学软件,对RAP-1进行抗原表位预测,并与其他重要的巴贝斯虫和泰勒虫相应基因序列进行比对,以筛选出抗原性和特异性均良好的基因片段;针对筛选出的基因片段设计引物,对该基因进行克隆和原核表达,最后利用Western-blot对重组蛋白的反应原性和特异性进行分析。结果显示,融合目的蛋白含His标签,分子质量为26ku左右,该蛋白只与双芽巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应,与其他主要巴贝斯虫、泰勒虫的阳性血清无交叉反应。结果表明,表达的PAP-1蛋白可作为ELISA诊断方法的候选抗原,为建立一种双芽巴贝斯虫病特异性的免疫学诊断方法奠定了基础。     

猪圆环病毒2型2d基因型毒株的全基因组序列分析

根据Gen Bank中猪圆环病毒2型(PCV 2)基因序列,设计特异性引物,用PCR方法从福州郊区某猪场疑似PMWS仔猪病料处理后接种育传三代的PK-15细胞中扩增1个分离毒株的全基因组,并将其克隆到p MD-18T载体上,对鉴定为阳性的重组质粒送检测序。对该分离株的基因全序列及其开放阅读框2(ORF2)进行同源性分析及遗传进化关系分析。PCR鉴定结果显示,本试验中分离到的病毒属于PCV2,命名为PCV2-FZ株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组大小为1 767 bp,含有11个开放性阅读框,其中ORF2大小为705 bp,共编码234个氨基酸。PCV2-FZ株与参考毒株基因全序列的核苷酸同源性为94.3%~99.4%,与SD毒株同源性最高,为99.4%;与DK1980PMWSfree和DK1990PMWSfree毒株同源性最低,为94.3%。分离株与参考毒株ORF2核苷酸同源性为89.2%~99.4%,其中与SD毒株同源性最高,为99.4%,与DK1980PMWSfree毒株和DK1987PMWSfree毒株同源性最低,均为89.2%。全基因组与ORF2序列遗传进化树分析均表明,PCV2-FZ株属于PCV2d基因型。本研究从福建省首次分离并鉴定了1株PCV2d型毒株,这对PCV2流行病学研究和遗传变异分析具有重要意义。     

卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为建立一种检测感染牛的卵形巴贝斯虫的敏感、快速方法,本研究根据GenBank中登录的卵形巴贝斯虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,通过优化反应条件,建立了检测卵形巴贝斯虫荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异地检测出卵形巴贝斯虫DNA,对瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫DNA的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.26 copies/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验的变异系数均小于3%。对60份临床牛血液DNA样本进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为41.67%和33.33%。结果表明,本试验建立的荧光定量PCR方法可用于对卵形巴贝斯虫定量分析和卵形巴贝斯虫病的分子流行病学调查。     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

猪流行性腹泻病毒YZ2016全基因组测序与稳定性分析

2016年我国江苏扬州某规模化养猪场暴发严重腹泻,本实验室通过RT-PCR确定其病原为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。将阳性样品接种Vero细胞,盲传5代后出现典型病变,并通过RT-PCR及间接免疫荧光试验确定成功分离到PEDV毒株,命名为PEDVYZ2016。采用分段重叠法对分离株基因组扩增测序,获得其全长序列。遗传进化分析显示PEDV YZ2016与近年流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株亲缘关系较远。PEDV YZ2016与BJ-2011-1、LZW全基因组核苷酸序列一致性可达99. 2%,与BJ-2011-1、OKN-1/JPN/2013 S基因推导氨基酸序列一致性可达98.5%。此外,分离株S基因发生多处点突变,导致其抗原表位及糖基化位点均发生部分改变。同时,序列比对分析显示不同代次的S、ORF3、N基因核苷酸突变率均极低。结果表明,本研究分离的PEDV YZ2016株属流行变异毒株,且在传代过程中遗传稳定性良好。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

应用三磷酸核苷水解酶基因检测弓形虫方法的建立

用Primer Explorer V4软件针对弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)基因设计了6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,建立弓形虫LAMP反应体系,并进行特异性和敏感性试验。结果显示,用该反应体系30 min即可检测出弓形虫NTPase基因,产生瀑布状的特异性条带,检测极限为20 copies,敏感性比PCR高10倍。与犬新孢子虫、鹦鹉热衣原体、柔嫩艾美耳球虫、吕氏泰勒虫、羊巴贝斯虫未定种和牛巴贝斯虫间无交叉反应,且重复性良好。应用此方法,可以在攻虫后第2天于试验猪血液中检测出弓形虫,比PCR方法提前2 d。表明将弓形虫NTPase基因作为环介导等温扩增检测弓形虫的目的基因,具有特异性强、敏感性高的特点,是快速诊断弓形虫病的一种新方法。     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。