猪德尔塔冠状病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立猪德尔塔病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)快速灵敏的诊断方法,采用RT-PCR方法扩增猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)M基因,将M基因克隆到载体pEASY-Blunt Cloning Kit,以构建出的重组质粒作为标准阳性质粒,并以此为模板建立PDCoV M基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性等验证。结果,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的Ct值与标准品模板在6.57×10~8～6.57×10~1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-4.215;该方法特异性强,对PEDV和TGEV猪常见病原检测均无特异性扩增;可重复性良好,组内和组间变异系数均小于2%;灵敏度可达6.57×10~1copies/μL;对临床样品的检测,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的阳性检出率为5.0%。上述结果表明,本研究成功建立了检测PDCoV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可实现对PDCoV的快速灵敏诊断。     

兔出血症病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测兔出血症病毒(RHDV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据RHDV VP60基因保守序列设计1对特异性引物和1条探针,进行条件优化,检测重复性、敏感性和特异性,建立了RHDV TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,标准品浓度在2.8×10~6~2.8×10~2 copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.8×10~1copies/L的标准品阳性质粒,变异系数小于2%。结果表明,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的RHDV,为我国RHDV的检测及其定量检测的相关研究提供了一种可靠的技术工具。     

非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速诊断方法,本研究根据ASFV SY18株p17蛋白的编码基因D117L的保守序列设计并合成引物和探针,建立了基于ASFV p17蛋白的编码基因D117L的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法的C_t值与标准品在1×10^9~1×10^1copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.192,检测下限为10 copies/μL,且与其他能引起相似症状的猪源病毒无交叉反应。重复性试验结果显示,组间与组内变异系数均小于1.920 7%,重复性好。此方法可用于ASF的早期诊断和ASFV快速检测。     

山羊关节炎脑炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测山羊关节炎脑炎病毒(caprine arthritis-encephalitis virus,CAEV)的快速诊断方法,本研究根据CAEV甘肃株Gag基因设计1对引物,并以含有CAEV甘肃株全基因组序列的质粒pUC57-CAEV为模板,建立CAEV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示,本研究所建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的Ct值与标准品模板在1.19×109~1.19×10^1 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997,斜率为-3.74,检测下限为1.19×10^1 copies/μL,且对痘苗病毒、山羊痘病毒均无扩增。重复性试验结果显示,批间与批内变异系数均小于1%,重复性好。本研究首次建立了CAEVGag基因的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法,为CAEV的快速检测和病毒感染预防提供了技术手段。     

牛流行热病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛流行热病毒(BEFV)的荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BEFV的G基因保守序列设计了1对特异性引物。结果显示,建立的标准曲线线性关系较好,其相关系数为0.996 3。该方法仅对BEFV检测为阳性,表明其特异性强。该方法的检测下限约为4.0×10~1 copies/μL,比普通PCR敏感性高10倍。重复性试验结果显示,该方法的组内和组间变异系数均小于0.76%。利用本方法分别对45份牛病料样品进行检测,结果检出了11份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法准确可靠,可以用于BEFV的快速诊断和定量分析。     

鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹦鹉博尔纳病毒4型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,通过扩增病毒M基因并与pMD19-T载体连接,构建重组质粒作为标准品,根据M基因序列设计特异性定量引物,进行了荧光定量PCR的敏感性、特异性、重复性试验。结果显示,荧光定量PCR比普通PCR检测灵敏度高100倍,可检出最低拷贝数为6.7×10~2 copies,μL的标准品,而普通PCR只能检测到最低拷贝数为6.7×10~4 copiesμL的标准品;用荧光定量PCR方法检测H5N6、H7N9、H9N2 AIV,NDV,IBV时均未见扩增;批内及批间重复变异系数均小于1%;对8只鹦鹉脑组织样品进行检测,荧光定量PCR检出阳性样品6份,普通PCR检出阳性样品4份,检出率两者相差25%。采用本方法对64份临床采集的鹦鹉粪便样本进行检测,结果筛选出阳性样品1份。以上结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于鹦鹉博尔纳病毒4型的检测。     

山羊痘病毒及口疮病毒ITR-059基因双重PCR检测方法的建立

为实现山羊痘病毒(GTPV)和口疮病毒(ORFV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及ORFV的059基因,分别设计用于普通双重PCR的引物2对、用于二联实时荧光定量PCR的特异性引物及探针2套;探针分别用5′JOE-Eclipse3′及5′FAM-TAMRA3′荧光染料标记物进行标记。结果显示,所建立的GTPV-ITR-L-ORFV-059双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达10~4copies/μL DNA;所建立的ITR-059二联探针实时荧光定量PCR方法可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达10~(2.87)和10~(2.52) copies/μL DNA。本研究初步建立了可同步特异性检测GTPV和ORFV的双重普通PCR及二联探针实时荧光定量PCR检测方法。     

痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为实现痘苗病毒的快速检测,根据痘苗病毒TA27L基因设计引物,经各项条件优化后,建立痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,同时将PCR扩增的TA27L基因克隆至pMD18-T载体,将测序正确的重组质粒作为标准品进行敏感性、特异性和重复性试验。结果显示,所建立方法的Ct值与标准品在7.58×10^9~7.58×10^2copies/μL范围内呈良好线性关系,R^2为0.997,斜率为-3.175,检测下限为75.8copies且具有良好的特异性。临床样本检测结果表明该方法较普通PCR方法的检出率更高。结果表明,建立的痘苗病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法为痘苗病毒及其相关基因重组毒株的生物学特性研究提供了必要的技术手段。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10~8～2.31×10~2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10~1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10~5～1.54×10~6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。     

猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的二重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建方法特异性良好,与其他25种常见细菌均无交叉反应。猪丹毒杆菌检测在2.07×108~2.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到2.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%;溶血性曼氏杆菌检测在1.07×108~1.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到1.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的二重荧光定量方法和普通荧光定量方法对47份临床样品进行检测,符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速地检测食品中致病性沙门菌的方法,针对沙门菌致病性菌株特有的invA基因设计引物,PCR扩增目的片段,构建重组质粒pMD19-T-inv285,将其作为标准品进行real-time PCR反应体系的优化和标准曲线的绘制,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测;同时用该方法对90份肉品样品进行检测。结果显示,建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程为y=-3.397 1 x+27.313,相关系数r2=0.999 6。该方法的灵敏度为5×100copies/μL,是普通PCR(5×102 copies/μL)的100倍。对10种常见食源性细菌的检测结果均为阴性;组内和组间重复试验的变异系数均低于1%。对90份肉品样品的检出率(6/90,6.67%)显著高于快速MALDI-TOF-MS法和传统的细菌分离鉴定方法(均为3/90,3.33%)。结果表明,本试验建立的致病性沙门菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于食品中致病性沙门菌的快速检测。     

毛皮兽阿留申病毒SYBR Green Ⅰ-qPCR检测方法的建立及病毒种鉴别

为建立快速定量检测、鉴别毛皮兽阿留申病毒的SYBR Green ⅠqPCR方法,以阿留申病毒属内病毒序列为参考,在VP2序列高变区的保守区段设计合成1对引物。结果,该方法检测水貂阿留申病毒(AMDV)、狐貉阿留申病毒(RF AV)的最低浓度分别为5.38×10~2copies/μL、5.93×10~2copies/μL,且通过熔解曲线可区分鉴别不同病毒种。对55份临床样品以及4株RFAV进行定量检测,结果,有13份PCR检测为阴性的样品被qPCR检测为阳性,说明qPCR检测方法的灵敏度优于普通PCR。上述结果表明,本试验建立的方法是一种高敏感性、特异性检测毛皮兽阿留申病毒,并可通过实测Tm值区分阿留申病毒的分子诊断技术。     

猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够准确、快速地鉴别猪肠病毒G型的诊断方法,本研究参考猪肠病毒G型的3D基因序列设计1对特异性引物,扩增片段预计大小约为104 bp,将3D基因片段克隆到pMD18-T载体上的阳性重组质粒作为标准品,建立猪肠病毒G型的实时定量PCR检测方法,并应用到临床样品的检测。研究结果显示,该方法设计的引物具有高度的特异性;标准曲线的Cq值与质粒标准品模板在2.92×10^8copies/μL^2.92×10^2copies/μL范围内,呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-4.023;组内与组间重复性试验显示变异系数很小,在0.26%~1.57%之间。该方法的最低检测限量可达2.92×10 copies/μL。使用本方法对2017-2019年广西部分地区的猪场临床腹泻粪便样品进行检测,猪肠病毒G型阳性检出率为18.42%,说明广西部分地区的猪场存在猪肠病毒G型的感染。本研究成功建立了猪肠病毒G型实时定量PCR检测方法,可用于猪肠病毒G型感染的临床检测。     

溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10~8~3.06×10~1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×101 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

鹅肾型星状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究旨在建立一种灵敏、快速检测鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。根据鹅肾型星状病毒的ORF1b保守序列,设计出1对引物,建立了检测该病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法的Ct值与标准质粒在2.42×10^4~2.42×10^9copies/μL范围内呈良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为24.2 copies/μL;该方法特异性强,对禽流感H9N2、鹅副黏病毒、鹅细小病毒、鸭坦布苏病毒均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于2.5%。运用该方法对动物回归试验中攻毒的雏鹅的各脏器进行检测,结果显示,肾、脾和肝中病毒含量较高,其次是胰腺、肺及肠道,而心和脑中的病毒含量最低。上述结果表明,本研究成功建立了鹅肾型星状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并根据此方法检测出该病毒对肾、脾及肝具有较强的亲嗜性,为该病原致病机制研究奠定了基础。     

猪PD-1分子及其配体的实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪程序性死亡因子PD-I及其配体PD-LI和PD-L2的基因序列,分别设计了特异性引物和TaqMan探针,以10倍系列稀释的重组质粒pMD-PD-1、pMD-PD-L1和pMD-PD-L2为标准品,对实时荧光定量PCR的条件进行优化,以建立定量检测这3个基因的方法.结果表明,建立的方法在1×10~2～1×10~8copies/μL模板范围内具有良好的线性关系(r~2>0.99),扩增效率均高于96%,可检测至少100 copies的阳性标准品.利用该方法对猪外周血单核细胞中这3个基因的表达情况进行了检测,结果也表明该方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可应用于临床样品的检测.     

绵羊肺炎支原体TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

本研究旨在建立一种灵敏性高、特异性强的检测绵羊肺炎支原体的TaqMan实时荧光定量PCR方法。根据GenBank上已发表的绵羊肺炎支原体HSP70基因序列设计引物和探针,构建标准阳性质粒,建立实时荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法标准曲线的线性关系良好,标准曲线的相关系数R2=1.000,斜率S=-3.334,扩增效率E=99.5%;敏感性高,可以检测出的最低样品浓度为1×101copies/L,是普通PCR的100倍;特异性强,能有效区分巴氏杆菌等9种病原;重复性好,组内、组间的Ct值变异系数均小于2%。运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法可简便、准确地鉴定绵羊肺炎支原体。     

PCV2型和PCV3型双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速、特异地鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的检测方法,本研究根据PCV2和PCV3保守区域基因序列,采用Primer Express 6设计了2对特异性的引物和2种不同荧光基团标记的TaqMan探针。经过引物筛选和条件优化,建立可鉴别检测PCV2和PCV3的双重荧光定量PCR方法。本方法能同时特异性地检测鉴别PCV2和PCV3,且与CSFV、PRV、ASFV、SVDV、FMDV、SVA病毒核酸没有交叉反应。本方法灵敏性强,PCV2和PCV3的最小检出量分别为48.1 copies/μL和58.3 copies/μL。组间和组内试验变异系数不超过1.5％,重复性好。结果表明,本研究创建了一种灵敏度高、特异性强的PCV2和PCV3双重荧光定量PCR方法。