丝胶对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响研究

精液冷冻保存过程中精子易受氧化应激影响而导致解冻后精液品质下降。丝胶具有良好的抗氧化能力,在精液稀释液中添加丝胶可有效抑制活性氧积累导致的脂质过氧化,减缓精子氧化应激。为了解添加丝胶对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响,本研究在冷冻稀释液中添加不同浓度（0、0.25%、0.5%、1%）的丝胶,进行精液冷冻保存。检测冻后精子活力、质膜完整性、顶体完整性及精浆中谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）水平。结果表明,与未处理组相比,添加0.5%丝胶可提高地中海水牛冻后精子活力、质膜完整性、顶体完整性、GSH-Px酶活性、T-AOC水平（P<0.05）,MDA含量显著降低（P<0.05）。0.25%和1%丝胶添加组精子冻后活力、质量参数和抗氧化能力无显著性影响（P>0.05）。稀释液中添加0.5%丝胶时,冻后精子抗冻标志物HSP70蛋白表达水平极显著高于未添加组（P<0.01）。结果表明,在精液稀释液中加入0.5%丝胶可提高精液的抗氧化能力,使精子免受氧化应激损伤,有效改善地中海水牛精液冷冻后的品质。     

黄芪多糖对冷冻前后猪精液中过氧化氢酶活性及其mRNA表达的影响

为了研究黄芪多糖对猪精液冷冻前后过氧化氢酶(CAT)活性及其mRNA表达的影响,用含不同质量浓度(0、0.2、0.4、0.6g/L)黄芪多糖的稀释液稀释美系长白公猪精液,用0.5mL细管分装冷冻,分别检测平衡后及冻融后精液中CAT活性和mRNA表达量的变化。结果显示,0.4g/L黄芪多糖能显著提高冷冻保存的猪精液中CAT活性及平衡后CAT mRNA表达(P0.05),同时冻融后CAT mRNA表达在冷冻组中最高(P0.05)。结果表明,冷冻前后猪精液中CAT活性及平衡后CAT mRNA表达的显著提高是黄芪多糖改善猪精液冻后质量的主要原因之一。     

高压均质(HPH)大豆卵磷脂替代卵黄在猪精液冷冻保存效果的研究

为探究大豆卵磷脂高压均质(HPH)处理对猪精液冷冻保存的影响,用6个浓度的经高压均质处理的大豆卵磷脂(A1:1%;A2:2%;A3:4%;A4:5%;A5:6%;A6:8%)替代Tris-柠檬酸-葡萄糖基础稀释液(B组)中的卵黄(20%)进行猪精液冷冻保存试验。冷冻-解冻后分别对精子活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性进行质量检测,同时利用各种试剂盒对解冻后精子的抗氧化指标、DNA完整率和凋亡指标进行检测。结果显示,当高压均质大豆卵磷脂浓度为5%时,精子活力、活率、质膜完整率和顶体完整率最高,分别为67.15%、62.54%、55.21%和52.96%(P0.05);冻后精子线粒体完整率和DNA完整率最高,为68.61%和64.39%(P0.05);凋亡率最低,为23.31%(P0.05);活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)最低,分别为337.59 U/m L和2.01 nmol/L(P0.05)。当添加6%的大豆卵磷脂时超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平最高,分别为74.65 U/m L和246.92 U/L(P0.05)。结果表明,利用5%高压均质大豆卵磷脂替代鸡蛋卵黄对猪精液冷冻保存具有良好的效果,能提高精子冻后质量、功能完整性和抗氧化性。     

褪黑激素对犬脂肪干细胞向雪旺细胞分化过程中凋亡发生的抑制作用研究

为了探讨褪黑激素(Mel)对犬脂肪干细胞(ADSCs)向雪旺细胞(SCs)诱导分化过程中凋亡发生的影响。本实验将犬ADSCs诱导分化为SCs,并使用免疫荧光法进行鉴定。采用CCK8法选取Mel的最佳浓度。应用q RT-PCR法和Western-blot法检测无Mel组和Mel处理组中ADSCs向SCs诱导过程中细胞凋亡相关基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2和Bax的m RNA和蛋白表达水平。结果显示,50 nmol/L Mel处理过的细胞活力最高;ADSCs向SCs诱导后S-100和GFAP呈阳性表达,并且观察到Mel的添加并不会影响到SCs的表型特征。ADSCs向SCs诱导后Bcl-2表达量明显低于对照组,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著高于对照组,细胞凋亡较多;在加入Mel后Bcl-2表达量显著升高,Caspase-3、Caspase-8和Bax的表达量显著下降。结果说明Mel可以显著抑制犬ADSCs向SCs诱导分化过程中的凋亡发生。     

三氧化二砷对鸡马立克氏病肿瘤细胞凋亡的影响

研究了三氧化二砷(As2O3)对诱导鸡马立克氏病(MD)肿瘤细胞株MDCC-MSB1细胞凋亡相关基因Fas、Caspase-3 mRNA表达及Caspase-3活性的影响,进而探讨了As203诱导MD肿瘤细胞株凋亡的机制.以体外培养MDCC-MSB1为研究对象,经终浓度分别为0、2、4和8μmol/L的As2O3.作用48 h后,采用荧光显微镜观察细胞的形态学变化,DNA Ladder法检测细胞凋亡情况,RT-PCR方法检测Fas、Caspase3 mRNA的表达水平,试剂盒比色法检测Caspase-3活性的变化.结果表明,As2 O3能引起典型的凋亡形态学变化,并出现典型的DNA Ladder,同时Fas、Caspase-3 mRNA的表达水平和Caspase-3活性均增加,组间差异均极显著(P＜0.01),呈现剂量依赖性.证实 As2O3诱导鸡MD肿瘤细胞株MDCC-MSB1细胞凋亡是通过增加Fas、Caspase-3 mRNA的表达和提高Caspase-3活性来实现的.     

高压均质(HPH)处理鸡蛋卵黄对猪冻精质量的影响

为探究高压均质(HPH)处理鸡蛋卵黄对猪精液冷冻效果的影响。选取Tris—柠檬酸—葡萄糖基础稀释液,以未处理的鸡蛋卵黄(20%EY)为对照组,添加经HPH处理后的鸡蛋卵黄(20%EY)为试验组,制成Ⅰ液和Ⅱ液,冷冻-解冻后分别对猪精子活力、活率、顶体完整率、质膜完整率、线粒体活性、抗氧化指标及DNA完整率和凋亡指标进行检测。结果显示,经HPH处理能有效提高猪精子冻后质量。精液解冻后精子活力、活率、顶体完整率、质膜完整率分别为84.32%、86.71%、68.92%、59.09%,较对照组分别提高了13.7%、16.58%、6.5%、4.88%(P0.05)。与对照组相比,试验组的MDA和ROS较对照组均有所上升(P0.05),SOD较对照组有所下降(P0.05)。但冻后精子NO和NOS含量显著降低(P0.05)。试验组的精子解冻后DNA片段完整性较对照组明显提高(P0.05),凋亡率下降(P0.05)。结果表明,HPH处理鸡蛋卵黄能有效提高猪精液冷冻后质量。     

超低温保存对姜曲海公猪精子超微结构损伤的研究

猪精子对低温尤为敏感,极易遭受低温损伤。本文旨在探讨冷冻前后猪精子超微结构变化,为改善猪精子冷冻保存方法奠定基础。通过手握法采集姜曲海公猪精液,使用0.25 m L细管对精液进行超低温冷冻保存,用扫描电镜和透射电镜对冷冻前后精子超微结构进行观察。结果显示,冻后姜曲海猪精子活力、质膜完整率、线粒体活性和顶体完整率(分别为38.6%、40.5%、42.7%和43.6%)均显著(P0.05)低于新鲜精子(分别为81.9%、85.7%、89.5%和90.2%)。姜曲海猪精子全长约54.4 m,由头、颈、体和尾4部分组成;冻后正常的精子,表现为质膜、顶体和线粒体结构完整,顶体光滑,线粒体排列整齐,核染色质均匀;冻后异常精子主要表现为颈部断裂或膨胀,顶体表面粗糙或缺失,质膜膨胀或缺失,或线粒体移位。上述研究结果表明,超低温保存对姜曲海猪精子超微结构造成的损伤主要集中于质膜、顶体和线粒体。     

棕榈酸致BRL 3A细胞脂肪变性过程中对自噬和凋亡的影响

为了探讨自噬和凋亡在棕榈酸(PA)诱导BRL 3A细胞脂肪变性中的作用机制,以不同浓度(0、0.2、0.4、0.6 mmol/L)PA处理BRL 3A细胞24 h,用油红O染色观察其对脂滴生成的影响,试剂盒测定TG含量的变化,Western-blotting检测LC3Ⅱ、P62、Bax和Bcl2蛋白的表达情况,流式细胞术检测细胞凋亡率。Western-blotting检测0.4 mmol/L PA处理细胞不同时间(0、6、12、24 h)以及0.4 mmol/L PA与5 nmol/L Baf A1共处理时LC3Ⅱ和P62蛋白的表达情况,观察PA处理对BRL 3A细胞自噬流的影响。结果显示,0.4mmol/L PA作用BRL 3A细胞24 h对细胞增殖无显著影响,但细胞内产生脂滴较多;TG含量随PA浓度增加而显著增加(P0.05或P0.01);LC3Ⅱ和P62的蛋白表达水平随PA浓度增加而上升;与对照组相比,0.4 mmol/L PA处理BRL 3A细胞12 h时,LC3Ⅱ的表达水平上升(P0.05),P62的表达水平下降(P0.05),而处理24 h时LC3Ⅱ和P62的表达水平均上升;与对照组相比,0.4 mmol/L PA与5 nmol/L Baf A1单独处理组LC3Ⅱ、P62相对表达量均升高(P0.01);与Baf A1单独处理组相比,PA与Baf A1共处理组LC3Ⅱ、P62相对表达量进一步升高(P0.01);随着PA浓度增加,细胞凋亡率增加,Bax/Bcl2值逐渐增加。结果表明,0.4 mmol/L PA处理BRL 3A细胞24 h可成功诱导脂肪变性,处理12 h内可使自噬水平升高,而处理24 h可使细胞发生自噬流阻滞和凋亡增加。     

线粒体钙超载在镉致PC12细胞凋亡中的作用

为探讨线粒体钙超载在镉(Cd)致PC12细胞凋亡中的作用,用不同浓度Cd(0、2.5、5、10μmol/L)培养液分别处理PC12细胞12 h,或用5μmol/L Cd和15μmol/L钌红(MCU抑制剂,RR)共处理PC12细胞12 h。通过流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体钙离子水平变化,Western-blot检测Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平。结果表明,PC12细胞凋亡率和线粒体钙水平随着染Cd浓度增加显著或极显著增强(P0.05或P0.01);RR能显著抑制Cd暴露引起的PC12细胞Caspase-3蛋白活化并促进Bcl-2/Bax蛋白比值升高(P0.05),显著抑制Cd暴露引起的PC12细胞凋亡率上升(P0.05),说明线粒体钙超载参与到镉暴露引起的PC12细胞凋亡过程中并具有一定的调控作用。     

纳米氧化锌对奶牛小肠上皮细胞增殖及凋亡的影响

为研究纳米氧化锌(nano-ZnO)对奶牛小肠上皮细胞(BIECs)增殖及凋亡的影响,本实验选取初生犊牛P3代十二指肠上皮细胞为试验对象,向培养基中添加0(对照)、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μg/mL不同浓度的nano-ZnO培养12 h后,通过倒置显微镜、CCK-8法检测细胞的生长状态和增殖活性;微量法检测LDH漏出量;DAPI荧光染色结合Image J图像测定分析nano-ZnO对BIECs凋亡的影响;实时荧光定量PCR对细胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表达进行测定。结果显示,与对照组相比,nano-ZnO低剂量各组(0.2、0.4、0.8μg/m L)细胞生长状态良好,核型正常,增殖活性增加,凋亡率无明显差异(P0.05),LDH漏出量无差异(P0.05);高剂量各组(1.6、3.2、6.4、12.8μg/m L)细胞皱缩变圆,密度减小,细胞核致密浓染、裂解,细胞增殖活性降低(P0.05),凋亡率明显升高(P0.05),LDH漏出量明显增加(P0.05);实验组基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2的相对表达量与对照组相比随着nano-ZnO浓度的增加呈现先增加后下降的趋势,Caspase-9的表达量随着nano-ZnO浓度的增加先下降后升高再下降,Bax随着Nano-ZnO浓度的增加而下降(P0.05或P0.01)。结论:nano-ZnO低剂量组对BIECs的增殖有促进作用;高剂量组能够抑制BIECs增殖,促进细胞凋亡。     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞(PGCs)传代培养的影响,将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养,即A组:基础液+10 ng/mL白血病抑制因子(LIF)+10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);B组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF;C组:基础液+20 ng/mLLIF+10 ng/mL bFGF;D组:基础液+20 ng/mL LIF;E组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF+20ng/mL干细胞因子(SCF);F组:基础液+20 ng/mL LIF+40 ng/mL bFGF+40 ng/mL SCF;G组(对照组):基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞(BEF)饲养层上进行传代培养。结果,原代时,A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组(P<0.05),其中E和F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05),而与B、C、D组差异均不显著(P>0.05);1~8代时,B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05);对照组传代数仅为2代,A组为5代,而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明,在传代过程中,LIF起主要作用,20 ng/mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。     

马齿苋对热应激小鼠空肠HSP70及肝脏抗氧化能力的影响

旨在探究马齿苋水提物(aqueous extract of Portulaca oleracea L.)对热应激小鼠空肠HSP70含量及肝脏抗氧化能力的影响。选取40只昆明种小鼠,随机分为4组:空白组(C)、热应激组(HS)、马齿苋水提物组(AEP)、维生素C组(Vc),每组10只。热应激组于40℃±1℃环境下每天处理0.5 h,其余时间置于30℃±1℃条件下,C组放置于25℃±1℃,连续6 d后,将小鼠置于25℃±1℃之环境给药治疗7 d。在给药治疗开始后第3天和第7天眶窦采血,处死后采集小鼠空肠、肝脏,测定各组小鼠血清HSP70含量、肝脏SOD、MDA及GSH-Px含量及空肠黏膜HSP70 mRNA表达量的变化。结果显示,与C组比较,热应激可显著提高小鼠空肠黏膜HSP70 mRNA表达量(P<0.01),提高肝脏SOD、MDA和GSH-Px的活性水平(P<0.01)。与HS组比较,给予马齿苋水提物后,可有效降低热应激小鼠血清HSP70含量和空肠黏膜HSP70 mRNA表达量(P<0.01)及肝脏MDA的活性水平(P<0.05),但对SOD和GSH-Px的含量无显著影响(P>0.05)。结论:马齿苋水提物能够通过降低热应激小鼠的氧化应激反应,减少热应激小鼠体内HSP70的表达量,达到良好的抗热应激效果。     

旋毛虫ES抗原对小鼠巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响

为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。     

鸡IL-2和IL-15基因真核表达质粒对禽流感疫苗的免疫增强作用

根据GenBank中的鸡IL-2和IL-15序列设计了2对引物,采用RT-PCR法从山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆了IL-2和IL-15基因,与pcDNA3.1连接构建了真核表达质粒pDNAIL-2和pDNAIL-15,研究了其对禽流感灭活疫苗的免疫增强作用。结果显示,免疫后第10d,pDNAIL-15 AI灭活疫苗组和pDNAIL-2 AI灭活疫苗组HI抗体水平显著高于AI灭活疫苗组(P<0.05)。免疫后第10 d,pDNAIL-15 AI灭活疫苗组CD4 淋巴细胞百分含量显著高于pDNAIL-2 AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组(P<0.05);免疫后第23 d,pDNAIL-2 AI灭活疫苗组CD4 淋巴细胞百分率显著高于pDNAIL-15 AI灭活疫苗和AI灭活疫苗组(P<0.05)。证实pDNAIL-2和pDNAIL-15能提高禽流感灭活疫苗的免疫效果。     

三聚氰胺对小鼠的致突变及致畸作用

选用昆明种小白鼠为研究对象,进行了三聚氰胺微核试验、精子畸形试验及致畸胎试验,以评价其致突变及致畸作用。结果显示,三聚氰胺在295.87～1 479.35mg/kg剂量范围内,小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率及PCE/NCE比值与阴性对照组无差异性(P>0.05);三聚氰胺中剂量组(591.74mg/kg)和高剂量组(1 479.35mg/kg)小鼠精子畸形率显著高于阴性对照组(P<0.05),精子畸形类型以折尾为主;三聚氰胺在19.72～98.62mg/kg剂量范围内,对孕鼠的生殖机能以及胎鼠的生长发育、外观、骨骼和内脏畸形无影响。结果表明,在本试验设计的剂量范围内,三聚氰胺无骨髓细胞毒性及致突变作用,对小鼠无胚胎毒性及致畸作用,但有精子致畸作用。     

复方苦芩对小鼠免疫功能及犬IL-4 mRNA和IFN-γ mRNA表达的影响

为了探讨复方苦芩对免疫低下小鼠免疫功能和对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响,将120只小鼠随机分为空白对照组、模型组(环磷酰胺造免疫低下小鼠模型,不给药)、阳性药物对照组(黄芪多糖注射液)、复方苦芩制剂高、中、低剂量组,连续给药7d,给药后,除空白对照组外,各组腹腔注射环磷酰胺0.2mL(80mg/kg)制造免疫低下模型,1次/d,共3d。于末次给药后第1小时,测定碳粒廓清指数、脾指数、胸腺脏器指数及T、B淋巴细胞转化率;建立犬细小病毒模型,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法观察复方苦芩对犬细胞因子IL-4mRNA、IFN-γmRNA表达的影响。结果显示,复方苦芩能增加小鼠脾指数和胸腺指数,明显增加T、B淋巴细胞的转化率和碳清值,降低犬细小病毒引起的犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA表达的增加,升高犬细小病毒引起的犬血清IFN-γ含量及其mRNA表达的降低。结果表明,复方苦芩具有增强小鼠非特异性免疫功能,降低犬血清细胞因子IL-4含量及其mRNA的表达,升高犬血清IFN-γ含量及其mRNA的表达的作用。     

TGF-β1对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA表达的影响

为研究外源性TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞表达CTGF mRNA的影响,用组织块法体外培养和纯化出奶牛乳腺上皮细胞,并应用免疫组织化学的方法鉴定细胞的纯度。然后用不同浓度的外源性TGF-β1(0,1,5,10ng/mL)作用乳腺上皮细胞,作用12,24,48,72h后分别提取细胞的总RNA,以β-actin作为内参基因,用实时荧光定量RT-PCR方法测定CTGF mRNA相对表达量的变化,并对CTGF的PCR产物进行测序分析。结果显示,TGF-β1处理组(1,5,10ng/mL)较对照组(0ng/mL)差异显著(P<0.05);处理组CTGF mRNA的相对表达量显著升高,并呈正量效关系:随着TGF-β1浓度的升高,CTGF mRNA的相对表达量基本呈逐渐升高的趋势。测序分析结果证明扩增产物为牛的CTGF基因序列,表明外源性TGF-β1可显著促进奶牛乳腺上皮细胞CTGF mRNA的表达,进而在奶牛乳腺纤维化过程中发挥作用。     

鸭源新城疫强毒株对番鸭细胞因子及Toll样受体mRNA表达的影响

为研究人工感染鸭源新城疫强毒株(Md/CH/LGD/1/2005)诱导番鸭细胞因子及Toll样受体基因的表达情况,选用80只15日龄SPF番鸭,随机分为攻毒组和对照组,每组各40只,攻毒组以滴鼻点眼的方式接种1×107.0EID50鸭源基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)Md/CH/LGD/1/2005,对照组接种灭菌的磷酸盐缓冲液。分别在攻毒后36 h、72 h、7 d和25 d剖杀10只番鸭,采集每只番鸭的骨髓、脾、盲肠扁桃体、哈德氏腺和法氏囊样品,通过Real-time RT-PCR方法检测组织中NDV载量、细胞因子和Toll样受体基因的表达。结果显示,除哈德氏腺外,其余各组织中病毒含量在攻毒后72 h达到最高,对照组各组织中均未检测到病毒含量。与对照组相比,经NDV感染后,IL-1β在攻毒36 h的法氏囊和攻毒7 d的哈德氏腺中表达量显著上调(P<0.05);IL-2、IL-6、IL-18和IL-20在攻毒7 d的脾内表达显著上调(P<0.05)。TLR3、TLR15和TLR21均在法氏囊内高表达(P<0.05),且表达趋势相同,对NDV感染的应答可能具有协同效应。TLR5在骨髓、脾、盲肠扁桃体和法氏囊内显著上调(P<0.05);TLR7在攻毒7 d的骨髓和法氏囊内表达上调(P<0.05)。结果表明,感染NDV后番鸭可能通过TLR相关的信号转导通路诱导宿主免疫抗性基因的表达,调控机体的抗病毒免疫应答反应。     

水牛cMyc基因与穿膜肽TAT的融合表达

为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,作者对影响水牛cMyc基因穿膜肽融合蛋白表达的因素进行了探索。应用双酶切定向克隆的方法,将水牛cMyc基因CDS(1 350bp)连接到pET-HA2-TAT载体中,构建成pET-cMyc-TAT载体,经酶切、PCR和测序验证,载体构建正确。将pET-cMyc-TAT载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,同时探索了其表达形式、诱导表达IPTG最优浓度和最优时间以及蛋白纯化咪唑洗脱的最佳浓度。结果表明,融合蛋白cMyc-TAT在37℃以包涵体的形式大量表达,IPTG终浓度0.001mmol/L,诱导5h为最佳诱导条件,纯化蛋白最佳咪唑洗脱浓度为145.76mmol/L,纯化蛋白经过Western-blot验证具有抗原性。研究结果为建立转录因子穿膜肽融合蛋白诱导水牛iPS细胞技术体系奠定了基础。