大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。     

不同浓度脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞对NF-κB及LAP表达的影响

为了观察不同浓度脂多糖对奶牛乳腺上皮细胞NF-κB及LAP基因表达的影响,设置不同浓度(0、50、100、200、400和800ng/mL)的脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞,分别于刺激2、4、8、16、24、48和72h后提取细胞总RNA,经反转录反应后,运用荧光定量PCR方法检测NF-κB P65亚单位和LAP的表达水平。结果,与空白对照组相比,脂多糖浓度达到400ng/mL并培养72h后,奶牛乳腺上皮细胞NF-κB P65亚单位和LAP的表达量最高,且与对照组有极显著差异(P<0.01)。结果表明,在脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎性效应中,NF-κB的表达活性增强,调控着防御基因LAP表达,呈现一定的剂量和时间效应关系。     

脂多糖诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB的表达

通过研究脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜上皮细胞核因子κB亚单位P65蛋白mRNA的表达变化,从细胞水平深入探讨子宫内膜炎的发病机理。将奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养,采用1、10、50、100、1000μg/mL五个浓度梯度的LPS刺激子宫内膜上皮细胞,MTT法筛选最佳刺激浓度;以上述最佳刺激浓度刺激细胞,于0、0.5、1、2、4h后收集细胞,荧光定量RT-PCR检测p65 mRNA的表达差异性。结果显示,100μg/mLLPS为最佳刺激浓度;LPS刺激1h组p65 mRNA的表达极显著(P0.01)高于其他时间组;2h组显著(P0.05)高于0、0.5和4h组;0.5和4h组显著(P0.05)高于0h组。结果表明,LPS可诱导奶牛子宫内膜上皮细胞NF-κB的激活,LPS介导的NF-κB信号通路存在于奶牛子宫内膜上皮细胞中,并参与子宫内膜炎发病机理的调控。     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞β-防御素mRNA相对表达水平的实时荧光定量PCR检测

为了检测培养的蒙古绵羊输卵管上皮细胞内sBD-1 mRNA表达水平,运用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术进行了相对定量测定.首先,建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为体外试验模型,提取细胞总RNA,根据GenBank中羊β-防御素基因序列,设计合成引物,进行实时荧光定量PCR.以β-Actin基因为内参基因,对sBD-1 mRNA进行均一化处理,利用荧光阈值(C2值)计算sBD+1 mRNA的相对表达量.经测序分析,扩增产物为β-防御素.结果显示,SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素mRNA表达水平的相对含量.     

IGF-I和EGF对牦牛乳腺上皮细胞SND1表达的影响

本研究旨在研究不同浓度胰岛素样生长因子I(IG F-I)和表皮生长因子(EGF)对牦牛乳腺上皮细胞SDN1(金黄色葡萄球菌核酸样都铎域1)表达的影响。选取纯化的第3代牦牛乳腺上皮细胞,分别加入0、50、100、200 ng/m L IGF-I或EGF,通过实时荧光定量PCR和免疫荧光检测它们对SND1基因表达及表达蛋白分布的影响。实时荧光定量PCR和免疫荧光分析显示:IGF-I可提高牦牛乳腺上皮细胞SND1基因的表达,且具有浓度依赖性,当IGF-I浓度为200 ng/m L时,SND1基因的白表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05);EGF也可提高SND1基因的表达,当EGF浓度为100 ng/m L时,SND1基因和的表达量最高,显著高于其他浓度组(P0.05)。SND1蛋白主要分布于牦牛乳腺上皮细胞胞核中。研究结果表明,IGF-I、EGF可通过调控牦牛乳腺上皮细胞SND1的表达来调节泌乳机能。     

金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染对BMEC炎性因子mRNA表达的影响

为了探讨金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)在不同时间点对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)相关炎性因子转录水平的调节作用。本试验通过体外培养BMECs并对其进行免疫细胞化学方法鉴定。选取纯化后的原代BMECs,分别加入活菌比(MOI)为100∶1的最佳浓度的金黄色葡萄球菌或大肠杆菌对细胞进行感染,分别在感染后第0、3、6、9、12小时采样,采用qRT-PCR法检测IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达情况。结果显示,在添加1×102CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第6小时IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L金黄色葡萄球菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。在添加1×101CFU/m L大肠杆菌作用至第6小时,IL1R1基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×103CFU/m L大肠杆菌作用至第9小时,IL-1β基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5);在添加1×104CFU/m L大肠杆菌作用至第12小时,TNF-α基因相对表达量显著高于其他时间点(P0.5)。本试验结果表明,使用最佳浓度金黄色葡萄球菌或大肠杆菌作用于BMECs时,在最佳感染时间点可显著上调IL1R1、IL-1β及TNF-α基因mRNA的表达量。IL1R1、IL-1β及TNF-αmRNA表达量在临床上可作为创伤后炎症反应的敏感指标,能评价炎症反应的严重程度,对乳腺炎的病程诊断具有重要意义。本试验结果为进一步研究细菌感染引起乳腺炎的致病机理提供了理论依据。     

FSH对仔猪睾丸支持细胞增殖和GDNF表达的调节

以原代培养的仔猪睾丸支持细胞(SC)为试验模型,研究了FSH对SC胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达及其增殖的影响。结果显示,外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达,而且这种促进作用具有浓度和时间依赖关系,GDNF蛋白水平随着FSH浓度的增加而升高,当FSH浓度为50 ng/mL时,GDNF水平达到最高,然后逐渐降低;FSH(50 ng/mL)作用30 min,可显著促进GDNF蛋白的表达(P<0.05),当FSH作用1 h时,GDNF蛋白水平达到最高,随后逐渐降低。FSH可以时间-剂量依赖性促进SC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,FSH(50 ng/mL)作用30 min时,PCNA的表达显著增加(P<0.05),作用1 h达极显著水平(P<0.01),至2 h时,PCNA蛋白的表达水平达到最高,随后逐渐降低。提示,FSH可在体外条件下通过刺激SC表达GDNF进而促进其增殖。     

鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。     

旋毛虫ES抗原对小鼠巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响

为探讨旋毛虫ES抗原对RAW264.7细胞TLR2/4mRNA表达的影响,分别取经0、2、5、15、30、45μg/mL ES抗原作用24h的RAW264.7细胞和用15μg/mL ES抗原作用0、3、6、12、18、24h后的RAW264.7细胞,采用半定量PCR方法检测TLR2和TLR4mRNA的表达水平变化。结果显示,随着ES抗原浓度的升高,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,15μg/mL ES抗原组与空白对照组相比差异显著(P<0.05)。在15μg/mL ES抗原作用24h内,随着作用时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,作用18h后的表达水平升高,且与空白对照组差异显著(P<0.05)。证实,ES抗原可刺激RAW264.7细胞表面受体TLR2/4表达升高,且存在一定的剂量和时间效应。     

脂磷壁酸体外诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症模型的建立与评价

旨在通过脂磷壁酸(LTA)诱导的方法,体外建立奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)炎症模型,为奶牛乳腺炎的研究提供合理模型。采用Ⅱ型胶原酶消化法分离培养BMECs,利用差时胰酶消化法纯化BMECs。通过测定BMECs骨架蛋白——角蛋白18对所培养的细胞进行鉴定,以确定其为BMECs,并用LTA侵染BMECs,以培养细胞的形态学特征和炎性因子作为炎症发生和发展的判断指标。用不同质量浓度(0、10、20、40、80 g/m L)的LTA对BMECs作用不同时间(12、24、48 h),采用MTT法检测细胞活力;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)快速检测奶牛肿瘤坏死因子(TNF-α)和奶牛白细胞介素1β(IL-1β)的蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测炎性应答标志TNF-α和IL-1β基因的表达水平,以确定建立模型的最佳质量浓度与时间。结果表明,在体外培养的BMECs特异性蛋白——角蛋白18表达呈阳性;MTT、ELISA和qRT-PCR试验结果显示LTA质量浓度为40 g/m L时处理BMECs 24 h可明显提高TNF-α和IL-1β的蛋白和基因表达水平。     

纳米氧化锌对奶牛小肠上皮细胞增殖及凋亡的影响

为研究纳米氧化锌(nano-ZnO)对奶牛小肠上皮细胞(BIECs)增殖及凋亡的影响,本实验选取初生犊牛P3代十二指肠上皮细胞为试验对象,向培养基中添加0(对照)、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μg/mL不同浓度的nano-ZnO培养12 h后,通过倒置显微镜、CCK-8法检测细胞的生长状态和增殖活性;微量法检测LDH漏出量;DAPI荧光染色结合Image J图像测定分析nano-ZnO对BIECs凋亡的影响;实时荧光定量PCR对细胞凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Bax、Bcl-2 mRNA的表达进行测定。结果显示,与对照组相比,nano-ZnO低剂量各组(0.2、0.4、0.8μg/m L)细胞生长状态良好,核型正常,增殖活性增加,凋亡率无明显差异(P0.05),LDH漏出量无差异(P0.05);高剂量各组(1.6、3.2、6.4、12.8μg/m L)细胞皱缩变圆,密度减小,细胞核致密浓染、裂解,细胞增殖活性降低(P0.05),凋亡率明显升高(P0.05),LDH漏出量明显增加(P0.05);实验组基因Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2的相对表达量与对照组相比随着nano-ZnO浓度的增加呈现先增加后下降的趋势,Caspase-9的表达量随着nano-ZnO浓度的增加先下降后升高再下降,Bax随着Nano-ZnO浓度的增加而下降(P0.05或P0.01)。结论:nano-ZnO低剂量组对BIECs的增殖有促进作用;高剂量组能够抑制BIECs增殖,促进细胞凋亡。     

雌激素受体在间情期绵羊输卵管上皮细胞中的表达

为探讨膜性雌激素受体GPER(G protein-coupled estrogen receptor 1)及雌激素核受体ERα、ERβ在绵羊输卵管上皮细胞中的表达和定位,探讨三种受体在间情期绵羊输卵管中的表达规律,通过RT-qPCR方法和免疫印迹方法分别检测了三种受体基因mRNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组化法对输卵管组织中三种受体基因进行定位并对结果进行光密度值分析。结果,输卵管上皮细胞中GPER相对表达量高于ERα、ERβ(P0.01),ERα的相对表达量高于ERβ(P0.05)。免疫组化结果显示,GPER广泛分布于绵羊输卵管上皮细胞中,主要定位于细胞膜及细胞质。而ERα及ERβ主要分布于绵羊输卵管上皮细胞的细胞核。阳性细胞光密度分析结果与荧光定量RT-qPCR的分析结果相一致。上述结果表明,间情期绵羊输卵管上皮细胞中同时存在GPER、ERα、ERβ三种雌激素受体表达,且GPER的平均光密度、mRNA相对表达量最高,ERβ的平均光密度、mRNA相对表达量最低。     

鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响

采用鸡枞菌多糖(TAP)体外作用于小鼠T淋巴细胞,用ELISA法检测其IL-4、IFN-γ及IL-2水平,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群,RT-PCR法检测相关细胞因子mRNA表达量,观察研究了鸡枞菌多糖对小鼠T细胞免疫功能的影响。结果表明,与ConA组相比,25～100μg/mL TAP在作用72h内均能显著促进T细胞产生IL-4、IFN-γ及IL-2(P<0.01);25μg/mL TAP作用48h后可显著降低被ConA激活的T细胞CD4+%(P<0.01),升高CD8+%(P<0.05),并降低CD4+/CD8+(P<0.05);50μg/mL TAP则可显著升高CD3+%(P<0.01);50μg/mL TAP在作用72h内能显著提高IL-2、IL-4及IFN-γmRNA表达量(P<0.01),并使其保持较高水平。提示,TAP对细胞免疫功能具有显著增强作用,T淋巴细胞是TAP的靶细胞之一。     

TGF-β1和Smad4及Smad7基因在体外培养的小鼠原代肾小管上皮细胞中表达情况的检测

采用肾小管节段贴块法培养小鼠原代肾小管上皮细胞,用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞种类,并用RT-PCR检测了原代肾小管上皮细胞中TGF-β1、Smad4和Smad7基因的表达情况。结果表明,TGF-β1、Smad4和Smad7基因在肾小管上皮细胞中均有表达。这为探讨上述基因在肾间质纤维化中的作用奠定了基础。     

环腺苷酸对体外培养的山羊乳腺上皮细胞增殖的影响

用环腺苷酸 (cAMP)对体外培养的山羊乳腺上皮细胞 (GMEC)进行试验 ,将细胞分为 8组。第 17组分别加入 1× 10、1× 10 2 、1× 10 3 、1× 10 4、1× 10 5、1× 10 6、1× 10 72nmol L的cAMP ;第 8组不加cAMP为对照组。结果显示 ,第 16组细胞倍增时间随cAMP浓度升高而递减 ,分别为 31.7、2 9.8、2 7.8、2 5 .6、2 3.8和 2 2 .0 2h ;当cAMP浓度达到 1× 10 72nmol L时 ,细胞倍增时间反而延长 2 6 .5 2h ,对照组细胞倍增时间为 30 .6 2h。结果表明 ,在一定浓度范围内 ,cAMP对GMEC有促进增殖作用 ,当cAMP浓度过高时则有抑制作用。cAMP对该细胞生长曲线的影响是在对数生长期。Westernblot结果证实 ,体外培养的细胞为GMEC ,cAMP诱导了该乳腺上皮细胞特异性产物酪蛋白的表达。     

钼对小鼠肾小管上皮细胞氧化损伤和骨架蛋白的影响

为研究钼(Mo)对小鼠肾小管上皮细胞的抗氧化功能及细胞骨架蛋白的影响,以小鼠原代肾小管上皮细胞为试验材料,通过向细胞培养基中添加0、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L不同浓度的Mo并培养24 h,用MTT法测定Mo对肾小管上皮细胞活力的影响,比色法测定氧化损伤程度,实时荧光定量PCR和Westernblot对细胞骨架蛋白Vimentin、α-actin、β-actin的m RNA和蛋白的表达进行测定。结果显示,与对照组(Mo剂量0组)相比,试验组(Mo剂量0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L组)小鼠细胞内的SOD和T-AOC均有下降(P0.01),而MDA升高(P0.01),LDH含量随Mo剂量的增加呈先下降后上升趋势(P0.01),CAT含量随Mo剂量的增加呈先上升后下降趋势(P0.01);同时,与对照组相比,试验组Vimentin、α-actin、β-actin的mRNA和蛋白的表达均随Mo剂量的增加而下降(P0.01或P0.05)。结果表明,高于0.4 mmol/L浓度的Mo作用24 h后,小鼠肾小管上皮细胞抗氧化能力受到抑制并加剧了细胞的氧化损伤,同时还会抑制Vimentin、α-actin、β-actin的mRNA和蛋白的表达。     

H5N1禽流感病毒感染雏鸭免疫器官TGF-β1 mRNA转录及病理损伤的变化

为了探索鹅源H5N1禽流感病毒(AIV)感染对雏鸭胸腺、脾脏、法氏囊的病理损伤及对TGF-β1mRNA转录的影响,将120只21日龄雏鸭随机分为AIV感染组(I)和对照组(C),应用RT-PCR和免疫组织化学技术结合病理学检测方法,对上述免疫器官的细胞凋亡数量、病理形态变化以及TGF-β1 mRNA转录进行了系统研究。结果显示,雏鸭感染AIV后第3～5天,免疫器官的病理损伤最为明显,脾脏、胸腺和法氏囊细胞凋亡数量分别在病毒感染后第1～5天、第3～5天显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于对照雏鸭。TGF-β1 mRNA转录均在病毒感染后第1～5天较对照雏鸭明显(P0.05)升高。上述研究结果表明,鹅源H5N1亚型AIV感染雏鸭后的初期,不但免疫器官第的淋巴细胞凋亡明显,而且TGF-β1 mRNA转录也明显升高;鹅源H5N1亚型AIV既是引起感染雏鸭免疫功能下降、呈现免疫抑制的主要因素,也是导致病毒感染雏鸭死亡的主要原因之一。     

黄芪颗粒对DON致BALB/c小鼠免疫损伤的保护作用

为探讨黄芪颗粒对脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)致BALB/c小鼠免疫抑制的保护作用,将48只BALB/c小鼠随机均分为空白对照组、黄芪对照组、DON组和黄芪-DON组。黄芪对照组和黄芪-DON组提前1周在饮水中添加黄芪颗粒(0.02 g/mL),连续5周;DON组和黄芪-DON组灌喂DON 2.4 mg/(kg·d),连续28d。每天观察体质量、采食量、脏器系数、病理组织学、血液学指标等的变化;采用ELISA试剂盒测定血清IL-1β、IL-2、IFN-γ、TNF-α、TGF-β水平变化,用实时荧光定量PCR检测上述细胞因子基因mRNA的表达,并采用流式细胞术检测脾CD4~+、CD8~+、CD3~+、CD19~+T细胞。结果显示,黄芪-DON组的体增重、采食量和脾系数显著高于DON组(P0.05),肝系数、肾系数显著减小(P0.05);通过病理组织切片观察,发现黄芪-DON组肝、肾的病变程度明显低于DON组;黄芪-DON组CD4+/CD8~+、CD19~+和血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、TGF-β水平均显著高于DON组(P0.05),脾中IL-2、IFN-γ、TGF-β基因mRNA的表达量也显著高于DON组(P0.05)。结果表明,黄芪颗粒能明显减轻DON所致肝、肾损伤,缓减DON诱导的免疫抑制,可显著提升机体的免疫水平。     

代谢产物对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体mRNA丰度的影响

为阐明代谢产物非酯化脂肪酸(NEFA)、β-羟丁酸(BHBA)和葡萄糖(GLU)在乳牛肝糖代谢、脂代谢中的调控作用,应用实时荧光定量PCR法观察了NEFA、BHBA和GLU对体外培养新生犊牛肝细胞胰高血糖素受体(GLNR)mRNA丰度的影响。结果,随着培养液中NEFA、BHBA和GLU浓度的升高,GLNR mRNA的表达量逐渐增加(P<0.01)。表明,代谢产物NEFA、BHBA和GLU直接调控乳牛肝胰高血糖素受体mRNA的表达。     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。