ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

地方流行型牛白血病(EBL)是由牛白血病病毒(BLV)引起的以淋巴细胞异常增生为主要特征的传染病。牛一旦感染则终生带毒,并且伴有病毒抗体存在,据此许多国家用免疫扩散试验(IDT)检测BLV抗体来分群隔离感染牛,旨在从牛群中清除牛白血病。然而IDT的敏感性有限,在结果判定上也易出现主观误差。近十年来,有许多学者将ELISA用于BLV抗体检测,试图建立一种敏感特异和快速的方法,结果因抗原提纯不过关而很少有成功的报道。我们用免疫亲和层析法提纯BLV抗原获得成功,抗原不但纯度高,而且彻底除去了犊牛血清中IgG的干扰,在此基础上建立了ELISA术式,取得了满意结果。     

单克隆抗体探针在地方流行性牛白血病诊断中的应用研究

应用3批牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp)抗原的单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别对1172头奶牛淋巴细胞样品进行了BLV抗原检测;还用琼脂免疫扩散(AGID)和酶联免疫吸附(ELISA)试验对这些奶牛的血清样品进行BLV抗体检测,作为MAB探针检测试验的回归对照。结果是3批探针对BLV洁净牛群抗原检测全部阴性;BLV污染群的1072头奶牛淋巴细胞样品的BLV抗原检测阳性率分别为39.1％,39.2％和39.3％;检出符合率达99.5％(McNemar检验P>0.05)。AGID和ELISA试验对BLV抗体检出阳性率分别为32％和41.1％。抗原和抗体检出的符合率在洁净群为100％;在污染群中分别为82.6％和84.5％。其结果经统计学分析证实,MAB探针检测BLV抗原是一种非常特异、敏感、稳定的检测技术。     

单克隆抗体技术诊断地方性牛白血病的研究

目前,用于牛白血病诊断的方法很多,但尤以血清学试验检测特异性抗体是诊断BLV感染最实用、经济、快捷和高度敏感的方法,如免疫扩散试验(ID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)等方法已被广泛应用。但研究结果表明,并非所有BLV感染的抗体阳性牛均发展成为肿瘤,其发病率低于感染牛中的5％(Burng等1980),因此在BLV感染率低的地区,可以将抗体阳性牛屠杀,以达到净化牛群的目的,而在BLV感染率高的地区这样做造成重大经济损失。目前,国外已使用单克隆抗体技术诊断地方性牛白血病。     

应用酶联免疫吸附试验检测羊衣原体性流产抗体的研究

免疫酶技术是一项新兴的免疫化学测定技术。而ELISA(酶联免疫吸附试验)用于人和畜禽的衣原体抗体的检测,只是近几年来才开展研究。自Lewis(1977年)报道了用ELISA法检测衣原体抗体以来。Evans(1982年)和Nancy J.(1983年)又分别报道了用ELISA检测人血清中衣原体抗体的试验,之后Evans(1983年)又发表了用ELISA法检测鸭血清中衣原体抗体的试验报告。他们通过ELISA与CF(补体结合反应)和MIF微量荧光试验)比较,认为ELISA是一种简单、方便、敏感的试验方法。用ELISA法检测羊衣原体抗体,在国内还未见报道。为此,我们进行了ELISA法检测羊衣原体抗体的试验。其结果:免疫及强毒感染山羊95％表现ELISA阳性;健康对照山羊均表现为阴性反应;从送检的流产山羊血清样品中,有61％查出了衣原体抗体。     

衣原体单克隆抗体在牛羊血清诊断上的应用

采用淋巴细胞杂交瘤技术,研制出的抗衣原体单克隆抗体,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,对本地区所采集的128份羊血清、90份牛血清进行检测.结果,羊血清阳性检出率为25.8%,牛血清阳性检出率为32.2%.选择50份羊血清、50份牛血清用已建立的检测衣原体抗体ELISA与间接血凝试验(IHA)进行比较,牛血清ELISA阳性检出率为32.0%,IHA为24.0%,ELISA比IHA试验高出8个百分点;羊血清ELISA阳性栓出率为26.0%,IHA为22.0%,ELISA比IHA高出4个百分点.     

检测口蹄疫病毒非结构蛋白3AB抗体的斑点免疫金渗滤法的建立

为建立一种能够区分口蹄疫疫苗免疫与野毒感染动物的快速检测方法,将纯化的口蹄疫病毒3AB非结构蛋白抗原包被在硝酸纤维素膜上,加入待检血清样品后,利用胶体金标记SPA显色。应用斑点免疫金渗滤技术(DIGFA)和ELISA方法同时对150份猪血清进行检测,结果DIGFA法的阳性率为6%(9/150),ELISA法的阳性率为5.3%(8/150),两者符合率达99.3%。DIGFA操作简单,耗时短,结果易于判断,且与口蹄疫免疫猪血清、猪细小病毒、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病病毒阳性血清不发生交叉反应。结果表明,该法适用于生猪和牛等口蹄疫病毒3AB抗体的快速检测。     

ELISA检测鸭病毒性肝炎抗体的研究

本文报道用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸭病毒性肝炎(DVH)抗体,并与琼脂免疫扩散试验(AGDP)进行了比较。ELISA的特异性与AGDP相一致;而在敏感性方面,ELISA的检出率为100％,而AGDP为60％。在ELISA抗体效价判定上,本文采用阳/阴血清OD值(P/N)≥2.1及阳性血清OD值不得小于0.4的综合阳性判定标准,减少了假阳性反应。研究表明,DVH抗体的ELISA检测法是一种快速、敏感,简便实用而准确的检测方法。     

PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒的研制及其应用

建立了一种检测猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验法(IPMA),并组装成PRRSV-IPMA抗体检测试剂盒。对该试剂盒的敏感性、特异性、重复性及保存期等进行了试验,并与国外IDEXX ELISA试剂盒进行了比较。结果显示,用该试剂盒检测PRRSV人工接种猪血清样品,第1周抗体阳性检出率为50%,从第2周起抗体阳性检出率均为100%,而对照组猪血清抗体检测均为阴性。该试剂盒重复性好,-20℃保存18个月稳定,与其他病毒参考血清无交叉反应,与国外IDEXX ELISA试剂盒的符合率为83.3%。用该试剂盒对采自黑龙江、吉林、辽宁、河北、上海等地13个猪场的520份正常猪血清样品进行了抗体检测,结果,4个猪场阳性率高达90%以上,仅有2个猪场为阴性,其余猪场阳性率为10%~57%。     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。     

NSP-ELISA鉴别FMDV感染与免疫

利用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒 (FMDV)非结构蛋白 (NSP) 3ABC多肽作为抗原 ,建立了一种可区分FMDV感染与接种灭活疫苗免疫牛的间接酶联免疫吸附试验 (I ELISA)。通过对 336份正常牛血清、50 8份注射疫苗牛血清、60份人工感染牛血清和 58份豚鼠免疫血清的检测 ,确定了血清抗体阴性与阳性效价的临界值。试验证明 ,该方法简易、快速 ,灵敏度比VIAA AGID高     

应用单克隆抗体探针检测牛白血病病毒抗原

应用抗牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp~(64))抗原单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别检测了培养细胞、生物制品及感染牛羊组织内BLV抗原。结果:FLK/BLV细胞系中BLV抗原生成规律为,培养1～4天时,细胞系中BLV抗原分泌量依日递增,5～7天时,抗原生成量趋于平衡;通过对3批琼脂免疫扩散(AGID)诊断抗原的检测可进行质量评价;实验感染BLV传代绵羊淋巴细胞内BLV-gp抗原全部阳性;我国江南某奶牛场200头奶牛淋巴细胞样品中,75头样品BLV抗原阳性。检出率37.5％。AGID法检出BLV抗体阳性牛56头,检出率为28％。两种技术检测的符合率为88.5％;哈尔滨市郊某奶牛场100头奶牛淋巴细胞样品,抗原抗体检测均为阴性。本方法特异性、敏感性强,为地方流行性牛白血病(BEL)的检测开辟了新途径,建立了新技术。     

绵羊注射棘球蚴包囊液后的血清抗体应答

为制备绵羊棘球蚴病间接血凝试验(IHA)的标准阳性血清,我们于1987年5月用棘球蚴包囊液对绵羊进行免疫,12个月内定期采血,以IHA法检测其血清抗体。结果发现免疫羊不仅血清抗体上升快,而且持续时间长。现将免疫前后绵羊抗体消长动态报告于后。     

牛霉形体免疫相关性蛋白P51的筛选与鉴定

为了筛选免疫原性蛋白,建立牛霉形体的快速诊断方法,利用二维凝胶(2-D)电泳、Western-blot分析及蛋白质谱分析,筛选出一个免疫相关性蛋白P51。以牛霉形体中国分离株Hubei-1为模板,扩增了p51基因,并克隆到原核表达载体pET32a上。结果显示,重组蛋白pET32a-p51与牛霉形体阳性血清的Dot-blotting试验结果为阳性,而Western-blotting试验结果为阴性。以pET32a-p51重组蛋白为包被抗原的ELISA试验表明其能与自然感染和人工感染牛霉形体的阳性血清发生特异性反应,而与灭活疫苗免疫的阳性血清不发生特异性反应,与牛传染性胸膜肺炎的阳性血清没有交叉反应。表明P51可能是牛霉形体特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,是一种有前景的诊断用抗原。     

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法.用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应.该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验.用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%.另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%.表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重.     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

用Dot-ELISA快速检测绵羊种布氏菌病

将斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)用于检测绵羊布氏菌(Brovis)感染并和常规ELISA、R-SAT、R-Coombs进行比较。结果在150份血清标本中Dot-ELISA的检出率为65.3％;ELISA 64.0％;R-SAT 38.6％;R-Coombs52.7％。并用50份S型布氏菌阳性血清和8份TB阳性血清进行了Dot-ELISA试验,结果全部阴性,未发生交叉反应。3次重复试验结果一致。结果证明本方法敏感性高,特异性强,操作简便快速,易于基层推广使用。     

PIHA及ELISA诊断人体旋毛虫病的研究

本研究首次将平板血凝试验(PIHA)用于诊断人体旋毛虫病。用本法与酶联免疫吸附试验(ELISA)同时检测5505份人体血清,阳性检出率分别为10.5％及11.48％,二者阳性检出符合率为97.8％。应用平板血凝试验检测5份人体活检阳性血清,阳性率达100％。其与囊虫、孢子虫、蛔虫、钩虫及鞭虫阳性血清共75份试验末见交叉反应。试验证明,该法具有敏感性高、特异性强、操作简便、快速准确等特点,可单独或与ELISA联合用于人体旋毛虫病的诊断和流行病学调查。     

H1与H3亚型猪流感病毒IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法的建立

有效防治猪流感需要借助于准确而快速的检测方法,为了建立一种高效、快速的多重检测方法,本研究应用H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白抗原偶联不同编码的荧光微球,应用间接法检测模式,建立了H1、H3亚型猪流感病毒IgG抗体荧光微球免疫学检测方法,并将该方法与血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验(VN)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较分析。结果表明,该方法的抗体检测灵敏度比ELISA方法高100～1 000倍;与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒及日本乙型脑炎病毒的阳性血清均无交叉反应,且两种亚型血清之间也不存在交叉反应。重复性试验表明,批内和批间精密度测试结果分别为10.2%和12.8%。与HI、VN和ELISA方法比较,总符合率分别为97.82%、98.27%和97.83%。综上,本研究建立的检测方法具有双重检测特性,特异性好、灵敏性高、重复性强,可用于H1、H3亚型SIV的鉴别诊断。     

斑点酶联免疫吸附实验诊断猪囊虫病的研究

用Dot—ELISA法诊断猪囊虫病在国内还属首次。该法在接到病料后2.5小时内准确报告结果,结果判定不但简易直观,不需酶标检测仪,而且还可作为技术资料长期保存。以抗原制备的快诊膜在室温下保存数月不失活,可通过信封邮递,从此彻底解决了基层单位多年来需要冰箱保存抗原和多年来抗原运输中存在的一系列难题,从而更加方便了基层。本法以纤维素膜作为载体,抗原用量由常规ELISA的100μl减少为1μl,其他器材和试剂用量也较常规ELISA少,因而大大降低了检测成本。与4种寄生虫病(棘球蚴、细颈囊尾蚴、旋毛虫、弓形虫)阳性血清不发生交叉反应。对按“四部”规程肉检确认为猪囊虫阴性血清314头份,阳性血清108头份,经Dot—ELISA法检测,其阴性符合率为99.36％,阳性符合率 为99.10％,对长春市肉联厂的784头份商品猪血清和辽、吉、黑、内蒙古四省区部队的3653头份猪血清进行检测,其猪囊虫病阳性检出率分别为5.36％和4.9％,与有关资料统计结果相符。对55头份阳性血清和60头份阴性血清进行4次重复性试验,其重复率达100％。实验结果证明,该法符合“简便、快速、敏感、准确、经济”的原则,尤其易于在基层推广应用。     

牛传染性鼻气管炎抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测

将无血清细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗原包被于硝酸纤维素膜,加入待检血清样品后,利用纳米胶体金标记的山羊抗牛IgG显色,建立了检测IBR抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测试纸盒。整个试验过程仅需5min即可判断结果,与蓝舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹泻黏膜病、猪瘟、猪伪狂犬病和猪细小病毒病的阳性血清不发生交叉反应。将该法与用于IBR抗体检测的ELISA方法同时对300份临床牛血清样品进行IBR抗体检测,结果二者的阳性符合率达94.4%。结果表明,该法具有特异、敏感、快速可靠、效果直观、结果容易判断的特点,非常适用于IBR的早期诊断和流行病学调查。