应用单克隆抗体探针检测牛白血病病毒抗原

应用抗牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp~(64))抗原单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别检测了培养细胞、生物制品及感染牛羊组织内BLV抗原。结果:FLK/BLV细胞系中BLV抗原生成规律为,培养1～4天时,细胞系中BLV抗原分泌量依日递增,5～7天时,抗原生成量趋于平衡;通过对3批琼脂免疫扩散(AGID)诊断抗原的检测可进行质量评价;实验感染BLV传代绵羊淋巴细胞内BLV-gp抗原全部阳性;我国江南某奶牛场200头奶牛淋巴细胞样品中,75头样品BLV抗原阳性。检出率37.5％。AGID法检出BLV抗体阳性牛56头,检出率为28％。两种技术检测的符合率为88.5％;哈尔滨市郊某奶牛场100头奶牛淋巴细胞样品,抗原抗体检测均为阴性。本方法特异性、敏感性强,为地方流行性牛白血病(BEL)的检测开辟了新途径,建立了新技术。     

牛白血病病毒前病毒DNA荧光PCR检测方法的建立及应用

为快速检测牛外周血淋巴细胞中的牛白血病病毒(bovine leukem ia vir,uBsLV)前病毒DNA,选取BLVenv基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件建立检测牛白血病前病毒DNA的荧光PCR方法,并对该方法进行敏感性、特异性和重复性评价及实际样本的验证检测。结果显示,该方法具有很高的特异性和重复性,最低检出限为每个反应可检出3个拷贝数的阳性标准质粒对照。在175头BLV抗体阳性牛中,用该方法共检出127头BLV感染牛。在262头BLV抗体阴性牛中,用该方法检出2头BLV感染牛,该方法与套式PCR之间检测结果的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的方法可用于BLV感染牛的确证。     

单克隆抗体探针在地方流行性牛白血病诊断中的应用研究

应用3批牛白血病病毒(BLV)糖蛋白(gp)抗原的单克隆抗体(MAB)探针(Probes),分别对1172头奶牛淋巴细胞样品进行了BLV抗原检测;还用琼脂免疫扩散(AGID)和酶联免疫吸附(ELISA)试验对这些奶牛的血清样品进行BLV抗体检测,作为MAB探针检测试验的回归对照。结果是3批探针对BLV洁净牛群抗原检测全部阴性;BLV污染群的1072头奶牛淋巴细胞样品的BLV抗原检测阳性率分别为39.1％,39.2％和39.3％;检出符合率达99.5％(McNemar检验P>0.05)。AGID和ELISA试验对BLV抗体检出阳性率分别为32％和41.1％。抗原和抗体检出的符合率在洁净群为100％;在污染群中分别为82.6％和84.5％。其结果经统计学分析证实,MAB探针检测BLV抗原是一种非常特异、敏感、稳定的检测技术。     

Dot-ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

用免疫亲和层析提纯技术获取高纯度的BLV抗原,并用EDTA处理被检血清,以免疫琼扩(ID)的检测结果为标准,建立一种快速特异的斑点酶联免疫吸附试验(Dot—ELISA),用于检测牛白血病病毒(BLV)血清抗体。其检测结果阳性者完全复盖并高于ID试验的检出率。而超出于ID试验的阳性部份,与ELISA法测得阳性结果完全符合。本法比ID试验高5.6％,并可提前60多个小时报告结果。比ELISA法亦可提前十几个小时得出结果。而且不需要特殊仪器设备,是一种特异性强,敏感性良好而且快速的免疫学检测方法。     

单克隆抗体技术诊断地方性牛白血病的研究

目前,用于牛白血病诊断的方法很多,但尤以血清学试验检测特异性抗体是诊断BLV感染最实用、经济、快捷和高度敏感的方法,如免疫扩散试验(ID)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫试验(RIA)等方法已被广泛应用。但研究结果表明,并非所有BLV感染的抗体阳性牛均发展成为肿瘤,其发病率低于感染牛中的5％(Burng等1980),因此在BLV感染率低的地区,可以将抗体阳性牛屠杀,以达到净化牛群的目的,而在BLV感染率高的地区这样做造成重大经济损失。目前,国外已使用单克隆抗体技术诊断地方性牛白血病。     

牛和绵羊IgG的抗原相关性及其在ELISA检测中的应用

通过双抗体夹心法和间接ELISA法表明,抗牛IgG与绵羊IgG之间有交叉免疫反应。其结果证实牛IgG与绵羊IgG存在共同的抗原决定簇。据此将检测牛IgG-BLV抗体的ELISA用于检测人工感染BLV绵羊抗体,结果特异;在抗体捡出时间上比AGIDT早,有实用价值。     

ELISA检测人工感染牛白血病毒绵羊抗体的研究

本病抗体检测方法以往多用补体结合反应和琼脂扩散试验,这些方法的敏感性有限,使对试验结果的分析不够深入,有时难以达到预期目的,为此,我们在牛白血病研究中,建立了检测绵羊BLV抗体的ELISA方法。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。     

ELISA双抗夹心法检测鸡IBV的研究

用差速离心结合不连续蔗糖密度梯度纯化的鸡传染性支气管炎病毒抗原免疫兔和鸡,获得高效价的多克隆免疫血情。经鸡胚胚体乳剂吸收和过DEAE-52纤维素柱提纯其IgG,建立了检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的ELISA双抗体夹心法。应用本ELISA对人工感染鸡和传染性支气管炎病鸡群的气管样本的检测,其病毒抗原阳性检出率分别为10O％(20/20)和78％(39/50)。实验结果表明,ELISA双抗体夹心法对鸡传染性支气管炎的早期诊断具有简单、快速、敏感性高、特异性强和重复性好等优点。     

应用F-81细胞检测牛白血病

牛白血病是由逆转录病毒科(Relroviridae)RNA肿瘤病毒亚科(Oncovirinae)C型肿瘤病毒群(Tgpe C oncovirus group)中的牛白血病病毒(Bovine Leukvirus)引起的肿瘤性传染病。1969年Miller等首先从白血病牛外周血淋巴细胞的短期培养物中检出C型病毒粒子。牛白血病病毒(BLV)能在牛、羊、犬、蝙蝠以及人的细胞培养物中增殖,但不引起细胞病变,不形成空斑和包涵体,这对BLV的检出造成一定的困难(Grares 1976)。Diglio和Ferrer(1976)指出,将BLV接种正常牛胎肾细胞可形成合胞体。但如用10代以上的继代细胞则合胞体的形成能力急骤下降。故通常应用转化细胞诱发合胞体形成,如禽肉瘤病毒转     

牛白血病病毒在人工感染羊体内分布的研究

成牛白血病(adult form of bovine lymlpho Sarcoma),是由牛白血病病毒( Bo-vine leukemia virus,简称BLV)感染而引起的,一种肿瘤性疾病。主要症状,是体表淋巴结肿大,消瘦、下痢或便秘,躺卧不起,泌乳量减少,眼球突出,心脏机能障碍,排尿困难,胸前浮肿等。在BLV感染牛体内,BLV颗粒进入到淋巴细胞染色体DNA,此时处于     

牦牛传染性鼻气管炎ELISA诊断方法的研究

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛疱疹病毒1型(BHV—1)引起的以呼吸道、眼和生殖道炎症为主要特征的传染病。目前已遍及欧、美、亚、非、澳各大洲的许多国家。随着我国对外贸易事业发展,IBR的检疫工作日渐重要。近年来,有些学者开展了用ELISA检测IBR病毒抗体的研究。但以牦牛IBR病毒为抗原来检测牛血清中的相应抗体,尚未见到报道。本文应用间接ELISA对四川炉霍县的牦牛、兰州地区一部分奶牛和云南曲靖地区的一部分水牛的血清进行了检测,取得了比较满意的结果。     

牛白血病

牛白血病(Bovine Leukemia)业已证明主要是由牛白血病病毒(BLV)引起的一种传染病,以造血器官的淋巴细胞异常增殖、全身淋巴结肿大和致死的恶性肿瘤为特征。临床表现为持续性淋巴增多症(PL)和淋巴肉瘤(LS)。BLV感染后可长期、甚至终身带毒,其中约有40％感染牛出现PL,只极少数PL牛发展为LS,大部分病例到老不发生瘤块。另约有35％的LS病牛没有PL病史。根据二者都有BLV引起和流行病学上的联系,丹麦、东德和苏联等国学者认为它们是白血病的二个不同发展阶段,前者是亚临床感染期,后者为临床明显期(肿瘤形成期);美国学者认为临床表现是根据不同的遗传因素所决定,PL是对BLV     

酶标记双抗原夹心法检测黄牛的腹腔指状丝虫抗体

国外丝虫病的酶标记检测方法从1975年Bartlett等用于盘尾丝虫和各种动物丝虫的检测。国内1985年有用ELISA法检测人工感染羊脑脊髓丝虫病(牛腹腔丝虫感染期幼虫对羊的侵袭病)的抗体的报道。本试验主要用辣根过氧化物酶(HRP)标记牛腹腔指状丝虫的大分子抗原,用双抗原夹心法检测牛腹腔指状丝虫的自然感染黄牛血清抗体。结果达到80％的阳性检出率,明显高于免疫双扩散试验的检出率。 (一)丝虫和血清来源     

应用胶体金标记免疫电镜技术观察牛白血病病毒

(一) 材料和方法 1. 材料:从国外引进的牛白血病病毒(BLV)感染的羊胎肾细胞(FLK)的初期培养物,羊抗牛BLV血清,兔抗羊IgG(以上原材料均由本所BL研究室惠赠);胶体金由本试验室制备。 2. 5nm粒径胶体金的制备:用鞣酸一枸橼酸三钠还原法制取。所得A液与B液的混合溶液呈亮红色。 3. 胶体金抗体(抗体包被胶体金)的制备:将胶体金的pH值用0.1M K_2CO_3液调到9.0,然后找出胶体金和第二抗体(兔抗羊IgG)最适结合比例,即用50μl(第二抗体含量     

牛传染性鼻气管炎抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测

将无血清细胞培养的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)抗原包被于硝酸纤维素膜,加入待检血清样品后,利用纳米胶体金标记的山羊抗牛IgG显色,建立了检测IBR抗体的纳米胶体金斑点免疫渗滤法检测试纸盒。整个试验过程仅需5min即可判断结果,与蓝舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹泻黏膜病、猪瘟、猪伪狂犬病和猪细小病毒病的阳性血清不发生交叉反应。将该法与用于IBR抗体检测的ELISA方法同时对300份临床牛血清样品进行IBR抗体检测,结果二者的阳性符合率达94.4%。结果表明,该法具有特异、敏感、快速可靠、效果直观、结果容易判断的特点,非常适用于IBR的早期诊断和流行病学调查。     

传染性法氏囊病病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达及其ELISA抗原反应性的分析

为分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP3蛋白的ELISA抗原反应性,将IBDVvp3基因插入杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-vp3并转化大肠杆菌DH10Bac感受态细菌,经抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac-vp3。用pBac-vp3转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-vp3。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞用Western-blot检测,在33ku处存在一条特异的蛋白条带;用间接免疫荧光试验检测时可见特异性荧光。以纯化的重组VP3蛋白为包被抗原建立了检测IBDV抗体的间接ELISA(VP3-ELISA),并与重组VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)进行了比较。对42份不同鸡血清中IBDV抗体的检测结果显示,VP3-ELISA的区分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA阳性检出率低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数低于VP2-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数。结果表明,在昆虫细胞中表达的重组VP3蛋白具有良好的特异性和抗原反应性,用它建立的ELISA的抗原反应性弱于用重组VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA的抗原反应性。     

SDS-PAGE、凝胶扫描、紫外吸收技术对牛白血病病毒抗原组份研究的应用

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)自六十年代产生以来,已成为蛋白质核酸研究的重要技术手段。特别是近年来,在此技术基础上产生的探针技技、印迹技术及指纹图技术已成为分子生物学领域不可缺少的研究手段。自1984年以来,我们应用SDS-PAGE结合凝胶扫描、紫外吸收法对牛白血病病毒(BLV)的抗原组份、各组份的分子量、相对百分含量及绝对含量进行了测定研究。通过对99批BLV抗原样品近千次测试结果表明,该技术在抗原组份研究中具有重要意义和实用价值。它可以为抗原的质量检测提供重要的理化参数,也可以为指导抗原的生产和制备工艺以及进出口的商品抗原的质量评价提供了一种     

猪圆环病毒1型抗体IPMA检测方法的建立及应用

建立了一种用于检测猪圆环病毒1型(PCV1)血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法.对该方法的反应条件、特异性、敏感性及重复性等进行了系统试验,并与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测结果进行了比较.结果显示,用IPMA法对已知PCV1和猪圆环病毒2型(PCV2)参考阳性血清进行检测,血清稀释度≥1:100即可消除2种病毒间的低水平交叉反应,与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应;与用昆虫杆状病毒表达的PCV1-Cap重组蛋白抗原建立的间接ELISA的检测符合率为88.9%.用该方法对黑龙江省、吉林省、河北省、上海市、辽宁省等地猪场送检的257份血清样品进行检测,PCV1和PCV2血清抗体阳性检出率分别为19.1%和80.5%,PCV1抗体阳性猪中有95.9%为PCV2阳性,表明我国猪群已存在PCV1感染,在临床上PCV1与PCV2多以混合感染形式存在.建立的PCV1-IPMA方法具有操作简便、特异和敏感等特点,不失为PCV1流行病学调查及血清抗体检测的有效技术手段.     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。