猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体的间接ELISA,将猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A和D克隆到pET-28a(+)载体中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)pLysS中进行表达。表达产物的分子质量为38ku,表达形式为包涵体。通过Western-blot证实,表达产物与猪传染性胃肠炎病毒多克隆抗体能够特异性结合。将重组蛋白经过8mol/L的尿素溶解后,作为间接ELISA的包被抗原,通过优化条件初步建立了检测猪传染性胃肠炎病毒血清抗体的间接ELISA。该方法与纯化的猪传染性胃肠炎病毒包被的间接ELISA相比,符合率达到91.53%。本研究结果对大规模地推广应用猪传染性胃肠炎间接ELISA诊断方法具有重要意义。     

鉴定“猪传染性胃肠炎”华株病毒为猪流行性腹泻病毒

自Doyle和Hutchings于1946年报告了美国在1945年发生的一种由病毒引起的猪传染性胃肠炎(简称TGE)后,接着一些国家用组织培养技术分离了病毒,并证明为冠状病毒[1、2、3、4、5、6、7、],迄今尚未证明不同猪传染性胃肠炎病毒株有血清型的差别。 1977年Wood报道:英国猪传染性胃肠炎的一部分是由一种在抗原性上和猪传染性胃肠炎病毒及猪轮状病毒不同的病毒株引起的[24]。1978年Pensaert和Debouck 报道了比利时四个猪场爆发的症状和流行病学与猪传染性胃肠炎相似的腹泻,并在电镜观察中见到多形性典型冠状病毒,但用初代猪肾细胞和次代猪甲状腺细胞培养物盲目传代时并未能分离出病     

鸡新城疫Ⅰ系苗防治猪传染性腹泻病的效果

干扰素是在特定诱生剂的作用下,由细胞基因组控制产生的一种具有抗病毒复制和肿瘤生长等多种生物学活性的蛋白质。它对几乎所有的病毒都有抑制作用,并在病毒性疾病的恢复中起着重要的作用。这些年来,绍兴地区每年冬春季节流行由猪传染性胃肠炎病毒引起的猪传染性腹泻病,经济损失严重,笔者应用新城疫Ⅰ系疫苗作为内源性干扰素诱生剂进行了防治猪传染性腹泻病的试验。(一)材料与方法 在猪传染性腹泻病流行季节(9月至次年3月)选取确诊为猪传染性腹泻病     

猪环曲病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速检测猪环曲病毒(PToV)的RT-LAMP方法,根据GenBank中发表的N蛋白基因序列,设计合成4条特异性LAMP引物,通过敏感性试验和特异性试验,建立了PToV RT-LAMP检测方法,并对71份临床粪便进行了检测应用。结果显示,本试验建立的PToV RT-LAMP检测方法在65℃60min条件下可扩增出特异性梯状DNA条带,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪环曲病毒的核酸无交叉反应;检测极限为10copies/μL,比普通RT-PCR的灵敏度高10倍,表明该检测方法具有较强的特异性及灵敏性。用建立的RT-LAMP方法进行的样品检测结果显示,受检的71份样品中有17份检测结果为阳性,该结果与常规RTPCR检测结果吻合,总的阳性率为23.9%。     

反向遗传技术及其在猪传染性胃肠炎病毒研究中的应用

对反向遗传学技术及其在RNA病毒研究中的应用进行了综述。论述了猪传染性胃肠炎病毒反向遗传技术的发展现状,并对该技术在猪传染性胃肠炎病毒的基因功能、致病机理、基因工程疫苗研究中的应用及前景等方面进行了探讨。     

用阻断酶联免疫吸附试验检测猪传染性胃肠炎病毒抗体和猪呼吸道冠状病毒抗体

用阻断酶联免疫吸附试验检测猪传染性胃肠炎病毒抗体和猪呼吸道冠状病毒抗体张净夏谦高晓燕王巧全韩国珍（上海动植物检疫局２０００３２）猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）是引起仔猪肠道疾病的冠状病毒，仔猪感染后主要表现为呕吐、水样腹泻乃至脱水，２周龄仔猪感染后死...     

猪传染性胃肠炎人工感染试验

近几年,国内许多单位对猪传染性胃肠炎开展了研究,在该病的诊断、治疗及其病原分离方面做了一些工作。 在猪传染性胃肠炎的研究过程中,我们用人工哺乳仔猪的方法多次地进行过感染试验,发现用人工哺乳仔猪做传染性胃肠炎感染试验,往往会受到饮食性腹泻的干扰。所以,后来改用母猪自然哺乳的仔猪做感染试验。现将试验情况和初步结果整理介绍如下。     

猪传染性胃肠炎病毒的血凝作用

将猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）Ａ株在ＩＢＲＳ２细胞上增殖，培养物经差速离心浓缩后与鸡红细胞出现了高凝集价（２８），这种凝集作用能被兔抗ＴＧＥＶ高免血清所抑制。试验的最适反应条件为体积分数０．５０％红细胞４℃作用１ｈ。通过反复试验，建立了一种简单实用的血凝抗原制备方法，病毒培养液不需浓缩可直接应用。     

减毒沙门菌递呈的猪传染性胃肠炎病毒S基因与猪IL-6基因双启动子DNA疫苗的构建

从猪传染性胃肠炎病毒克隆质粒pMD19T-S中扩增了2.1kb的S基因片段(含完整的A、B、C、D 4个抗原位点序列),以RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增了猪白细胞介素6(IL-6)(658bp),插入同一双启动子真核表达载体pVAXD的2个多克隆位点,构建了共表达S与IL-6基因的双启动子表达质粒pVAXD-S-IL-6,转染COS7细胞进行转录和表达鉴定。将质粒pVAXD-S-IL-6电转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,筛选获得重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6),并对重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)的体外稳定性和口服小鼠的安全性进行了鉴定。结果表明该双启动子真核表达质粒pVAXD-S-IL-6构建成功,RT-PCR检测到转染的COS-7细胞中2个目的基因的转录,间接免疫荧光试验结果显示表达产物可与猪抗猪传染性胃肠炎病毒血清发生特异性反应。重组菌株SL7207(pVAXD-S-IL-6)在含卡那霉素的抗性培养基中稳定性好,以1×109 CFU灌胃接种小鼠具有良好的安全性。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒的新型口服疫苗株SL7207(pVAXD-S-IL-6),为开展其免疫原性评价奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的血清学方法,本研究以原核表达的猪流行性腹泻病毒AH2012株N蛋白为包被抗原,通过条件优化建立了一种快速的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。利用该ELISA检测猪流行性腹泻病毒血清时为阳性,而与猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、口蹄疫病毒,猪圆环病毒2型、猪呼吸道冠状病毒的阳性血清均无交叉反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5.55%;该方法与中和试验检测结果总符合率为88.75%。本研究建立的方法可以应用于我国猪流行性腹泻病毒的诊断、流行病监测以及疫苗研发时抗体水平的检测,为该病的防控提供一种有效的检测工具。     

类冠状病毒CV_(777)引起仔猪实验性肠道感染

同猪腹泻有关的病毒,主要是冠状病毒科的传染性胃肠炎(TGE)病毒和猪轮状病毒。这两种病毒在小肠绒毛上皮细胞的细胞质中进行复制,以后随着上皮细胞的破坏和脱落,导致绒毛缺损。由于病毒复制引起细胞形态和功能的改变而发生腹泻,尤以乳猪为甚。脱水可引起死亡,TGE更是如此。     

应用RT-nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究

将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ0 2 ,经过胰酶处理后 ,在Vero细胞上增殖。利用Gen Bank中的基因序列设计合成了 2对M基因引物 ,应用RT PCR和RT nestedPCR分别扩增出HLJ0 2的 85 4bp的M全基因片段和 41 2bp的M基因部分片段 ,而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明 ,RT nestedPCR可用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌的构建及其免疫原性的研究

为探究表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌口服免疫动物诱导的特异性免疫应答,本研究构建了p MG36e-SLN重组质粒并将其电转化至乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中,制备表达猪传染性胃肠炎病毒SLN基因的重组乳酸乳球菌,经SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定目的基因表达,并将重组菌口服免疫新西兰大白兔,利用间接ELISA方法测定家兔小肠黏膜和血清中抗SLN蛋白特异性Ig G和Ig A。结果显示,表达重组SLN蛋白的重组菌经口服能够有效引起动物体产生较高水平抗SLN蛋白Ig G和一定量的抗SLN蛋白Ig A,表明该重组菌表达系统能刺激动物免疫系统产生应答,具有作为口服疫苗的潜在应用价值。     

猪瘟病毒荧光RT-PCR快速检测方法的建立

以猪瘟病毒5′端非编码区为靶核酸序列设计引物和探针,建立了一步法荧光RT-PCR检测猪瘟病毒。荧光RT-PCR仅检测出猪瘟C株、T株,未能检测出牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪呼吸系统冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、PK-15细胞和牛睾丸原代细胞;对猪瘟病毒T株的扩增反应产物进行了测序分析,与预期序列相符。荧光RT-PCR的检测极限可达到1 TCID50/mL,整个试验流程只需2 h。采用荧光RT-PCR和抗原捕获ELISA同时检测临床病料、猪副产品共207份样本,两种方法的检出率分别为17.4%和13.5%,两者符合率为95.7%(198/207);荧光RT-PCR的检出率高于ELISA,两者差异显著。结果表明,建立的荧光RT-PCR可用于猪产品、临床病料中猪瘟病毒的快速检测。     

用细胞培养分离猪传染性胃肠炎病毒并和美国两个参考毒株的比较

多年来在加拿大曾观察到数量较多的猪传染性胃肠炎(CET)的临床病例,这些材料,特别是有关流行病学和小猪试验感染的材料是很有意义的。本研究报告是用猪细胞培养分离出的病毒来肯定临床病例,并将分离的毒株同美国的两株参考毒作了比较。     

猪肠道冠状病毒感染机制的研究进展

猪肠道冠状病毒(swine enteric coronavirus,SeCoV)是引起猪病毒性腹泻的重要病原,在世界范围内广泛流行,给全球养猪业带来了危害。本文综述了4种主要的猪肠道冠状病毒感染机制的研究,即传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV),包括通过受体APN侵入细胞并诱导宿主细胞凋亡、逃逸宿主的天然免疫,以及与宿主细胞内质网应激系统相互作用的机制,以便为猪肠道冠状病毒研究及相关疾病防控提供参考。     

猪传染性胃肠炎病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)直观、特异和快速的检测方法,将TGEV接种PK-15细胞后,以抗TGEV N蛋白的单克隆抗体为一抗,荧光素FITC标记的山羊抗小鼠Ig G为二抗,建立了TGEV的间接免疫荧光(IFA)检测方法。结果显示,TGEV的最佳接种效价为1×102TCID50,培养时间为24 h,细胞最佳固定液为40 m L/L多聚甲醛,最佳封闭条件为10 g/L BSA 37℃封闭30 min,一抗的最佳使用浓度为1 ng/L,二抗的最佳稀释度为1∶100。对常见的猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒和猪圆环病毒2型等猪病病原检测均为阴性。结果表明,建立的检测方法对TGEV具有良好的特异性。本研究建立的方法为TGEV的实验室诊断及TGEV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的检测手段。     

猪传染性胃肠炎病毒对猪肾传代细胞的适应性观察

据报道猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)可在猪睾丸传代细胞(ST)、胎猪或新生猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、肾细胞(ESK)、睾丸细胞(EST)等上繁殖。但我们尚未见到用猪肾传代细胞(IBRS_2)繁殖TGEV而提高其毒价的报道。 (一)材料和方法 1.种毒:Purdue毒株,1985年从美国动植物检疫局兽医诊断室引进,后用EST细胞繁殖,1987年3月测定毒价为10~2 TCID_(50)/0.05ml。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间片段的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点B与C之间的目的片段经克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导重组菌株表达其融合蛋白.结果显示,目的片段的大小为357bp,序列分析表明,S基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测表明,分子质量约34ku的融合蛋白具有良好的反应原性.