PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为了快速检测猪流行性腹泻病毒,本研究以纯化的家兔抗猪流行性腹泻病毒多隆抗体为捕获抗体,以小鼠抗猪流行性腹泻单克隆抗体为检测抗体,并对单克隆抗体进行HRP标记,由此建立了双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测法,检测抗体的最佳工作浓度为浓度为0.75ug/m L。当D450≥0.233且P/N≥2时判定为阳性。该方法特异性强,与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒均无交叉反应,最低检测量为3.125×10~3TCID_(50)/m L。该方法重复性较好:批间和批内重复率均小于10%,临床样品检测结果与RT-PCR方法比较,符合率为90.5%。上述结果表明,本研究建立的检测猪流行性腹泻病毒的双抗体夹心ELISA特异性强、灵敏度高,可用于对猪粪样中PEDV的检测。     

猪轮状病毒间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪轮状病毒VP6蛋白作为检测抗原,建立检测猪轮状病毒血清抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被量为6μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶5 000。应用该方法检测阴性血清样本30份,确定的检测临界值为0.143(D490nm≥0.143,则判定为阳性)。特异性试验表明,用建立的间接ELISA对传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒和伪狂犬病病毒阳性血清进行检测时无交叉反应。重复性试验证实,批内和批间变异系数均小于10%。结果表明,本研究建立的用以检测猪轮状病毒抗体的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可应用于猪轮状病毒的病原学检测。     

猪萨佩罗病毒VP1蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

为建立猪萨佩罗病毒(PSV)的快速检测方法,本试验以重组VP1蛋白为包被抗原建立了检测PSV Ig G的间接ELISA方法。RT-PCR从PSV分离株SHCM2019中扩增VP1基因,将其克隆到原核表达载体p ET28a,对重组质粒pET28a-VP1进行原核表达,经Western-blotting检测后,利用VP1重组蛋白建立检测猪血清中PSV Ig G抗体的间接ELISA方法。结果显示,表达的VP1蛋白分子质量约为40 ku,与预期大小相符,Western-blotting表明,重组蛋白与PSV抗体阳性血清具有良好反应原性。以VP1蛋白为抗原建立的ELISA方法与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清均无交叉反应,特异性好;批内和批间的变异系数均小于10%,重复性好。利用建立的间接ELISA方法对95份猪临床血清样本进行检测,阳性率为44.21%。本研究建立的检测方法为PSV的血清学诊断提供了可靠手段。     

猪嵴病毒重组VP3蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)血清抗体的间接ELISA检测方法,以原核表达的重组VP3蛋白为检测抗原,优化ELISA检测条件,建立了PKV抗体的间接ELISA检测方法。该方法仅对PKV血清检测为阳性,对于能够引起猪病毒性腹泻的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒阳性血清检测均为阴性。临床血清样品的检测结果表明,建立的ELISA检测方法与RT-PCR方法的阳性符合率较高。结果表明,建立的以重组VP3蛋白为包被抗原检测PKV血清抗体的ELISA方法可以用于检测PKV的感染及相关流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒S2蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用

本研究基于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S2截短蛋白,建立了特异性Ig G抗体的间接ELISA检测方法,用于临床PEDV特异性抗体水平的监测。前期筛选了富含中和表位的S2截短基因,体外表达后作为ELISA包被抗原,用于捕获PEDV Ig G抗体,以山羊抗猪HRP-Ig G作为二抗,通过条件优化,建立了检测猪血清中PEDV Ig G抗体的间接ELISA方法。最佳反应条件为:S2抗原蛋白的最佳包被浓度为2μg/m L,临床血清样品和酶标二抗的最佳稀释倍数分别为1∶400和1∶20 000。该方法的批内和批间重复变异系数(CV)分别为1.81%～8.52%和1.18%～7.41%,重复性较好;该方法检测猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的阳性血清时结果均为阴性,特异性较强。该方法与商品化PEDV抗体检测试剂盒相比较,阳性符合率为95.18%,阴性符合率为91.43%,说明该方法可用于临床血清抗体筛查。进一步利用此方法对324份猪的临床血清样品进行检测,发现PEDV抗体阳性血清占62.96%,与临床现状基本吻合。上述结果表明,该方法适用于临床猪群中PEDV Ig G抗体水平普查,为PEDV的疫病防控及灭活疫苗评价提供了有效的技术支持。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因的截短表达及间接ELISA检测方法的建立

为对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的M蛋白进行截短原核表达并建立ELISA检测方法,设计引物扩增了含M基因抗原位点的基因片段,并构建了原核表达载体pET-32a-dM;将pET-32a-dM转化大肠杆菌Rosetta(DE3),获得了高效表达,表达产物大小为27ku。蛋白免疫印迹结果显示,该重组蛋白具有良好的抗原活性。以重组蛋白为抗原建立了间接ELISA检测方法,方阵滴定试验确定重组蛋白抗原的最佳包被质量浓度为13.07μg/mL,血清稀释度为1∶80,酶标抗体1∶4 000稀释。阳性判定标准确立为D450nm≥0.3,反之则判为阴性。建立的ELISA与猪乙型脑炎病毒、胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌的阳性血清均无交叉反应,说明它特异性好。批内与批间重复性试验的平均变异系数分别为3.53%及6.82%,说明重复性较好。用该方法检测52份血清,特异性为87.5%,敏感性为90.0%,与商品化ELISA试剂盒的符合率为88.5%。本研究结果表明,截短表达的M蛋白可以作为诊断抗原,建立的ELISA方法完善后可用于PRRSV抗体的检测。     

猪瘟病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速、准确的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,根据Gen Bank上猪瘟兔化弱毒全基因序列,设计1对引物,扩增E2蛋白主要抗原区基因片段;然后,将其克隆入载体p ET-28a(+),采用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达出含E2蛋白主要抗原区的重组蛋白。以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA。经过优化,确定最佳抗原包被浓度为8 g/m L,待检血清稀释倍数为1∶160,酶标二抗稀释倍数为1∶2000。该方法的阳性临界值为0.37,阴性临界值为0.32。批内变异系数在1.58%~3.33%之间,批间变异系数在2.67%~5.35%之间,说明该方法重复性良好。特异性检验中,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清均没有交叉反应。用该方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对1 101份临床猪血清样品进行符合性检测,结果,该方法的敏感性、特异性、符合率分别为89.07%(603/677)、77.59%(329/424)和84.65%(932/1101)。上述结果表明,该方法可用于临床CSFV血清抗体的检测,为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。     

猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用

利用伪狂犬病病毒(PRV)ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为:包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为:血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%PI28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。     

H1与H3亚型猪流感病毒IgG抗体双重荧光微球免疫学检测方法的建立

有效防治猪流感需要借助于准确而快速的检测方法,为了建立一种高效、快速的多重检测方法,本研究应用H1和H3亚型猪流感病毒(SIV)的血凝素(HA)蛋白抗原偶联不同编码的荧光微球,应用间接法检测模式,建立了H1、H3亚型猪流感病毒IgG抗体荧光微球免疫学检测方法,并将该方法与血凝抑制试验(HI)、病毒中和试验(VN)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行比较分析。结果表明,该方法的抗体检测灵敏度比ELISA方法高100～1 000倍;与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒及日本乙型脑炎病毒的阳性血清均无交叉反应,且两种亚型血清之间也不存在交叉反应。重复性试验表明,批内和批间精密度测试结果分别为10.2%和12.8%。与HI、VN和ELISA方法比较,总符合率分别为97.82%、98.27%和97.83%。综上,本研究建立的检测方法具有双重检测特性,特异性好、灵敏性高、重复性强,可用于H1、H3亚型SIV的鉴别诊断。     

牛地方流行性白血病液相蛋白芯片检测方法的建立

应用xMAP液相芯片技术原理,以原核表达的重组牛白血病病毒gp51蛋白为抗原,建立了检测牛白血病病毒抗体的LiquiChip液相蛋白芯片检测方法,并进行了特异性、敏感性、重复性与稳定性试验。结果表明,该方法对牛白血病病毒阳性血清检测阳性,对其他常见牛病毒阳性血清检测阴性,表明特异性好;液相蛋白芯片方法对牛白血病病毒抗体的检测敏感性可达119.7ng/μL,对多份牛白血病病毒阳性血清的检测结果显示该方法的检测敏感性与商品化ELISA试剂盒无显著差异;对3份牛白血病病毒阳性血清进行4次重复检测,批内、批间的变异系数均低于10%。所制备的偶联微球芯片保存3个月,其检测结果无显著差异。采用该方法对169份临床牛血清样品进行检测,检出阳性率达57.4%,该检测结果与瑞典进口ELISA试剂盒检测结果的符合率为94.67%。本方法为牛地方流行性白血病的进出境检疫、疫病监测和流行学调查研究提供了一种特异、敏感的新型快速检测技术。     

基于非洲猪瘟病毒p72蛋白的阻断ELISA检测方法的建立及初步应用

本研究以真核表达的非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白为包被抗原,以抗ASFV p72蛋白的特异性单克隆抗体为检测抗体,经条件优化,建立了特异性检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。结果显示,最佳抗原包被量为100 ng/孔,待检血清样本最佳稀释度为1∶2,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000。该阻断ELISA方法的结果判定标准:当血清样品的PI≥41.84%时,判定为阳性;当血清样品的PI41.84%时,判定为阴性。特异性试验结果显示,该方法仅能与非洲猪瘟病毒阳性血清反应,与PRV、PCV2、PRRSV、CSFV和PPV等猪病疫苗毒阳性血清无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%;与商品化ELISA试剂盒的对比检测结果表明,两种方法的符合率为100%。上述结果表明,本研究建立的基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法可以应用于ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及疫情监测提供了有效的检测手段。     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

猪轮状病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用差速离心法纯化的猪轮状病毒(RV)分别免疫仔猪和兔,制备了猪抗RV和兔抗RV超免疫血清,并用层析方法进行了纯化,建立了检测RV的双抗体夹心ELISA方法.结果表明,该双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为:猪抗RV IgG包被浓度为4 μg/mL,兔抗RV IgG最佳工作浓度为3.5μg/mL,样品反应时间为90 min,酶标抗体工作浓度为1:8 000,以D<,450nm≥10.161作为阳性判定标准.该ELISA的重复性变异系数小于10 %,最低检测限为1.25μg/mL,并与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温和4℃条件下至少可保存4个月.用该ELISA方法和RV金标检测卡检测70份临床粪便样品,结果显示,ELISA的阳性检出率为22.9%,而金标检测卡的阳性检出率为20.0%.表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和重复性好等优点,可用于RV的快速检测.     

猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,经ELISA反应条件优化、特异性试验、重复性试验及与中和法、IDEXX ELISA对比试验建立了特异性ELISA。用此方法对福州市周边20个猪场的222份猪血样进行了BVDV抗体检测。结果显示,本ELISA反应条件为:BVDV Oregon C24V与NADL株联合包被(质量浓度均为31.25μg/L,每孔加50μL)的条件为37℃1h加4℃8h,家兔抗猪瘟病毒(CSFV)超免疫血清(每孔血清效价可中和400RID CSFV)阻断时间为2.0h,封闭剂和血清稀释液中NaCl的浓度和Tween-20的体积分数分别为0.7mol/L和3.00mL/L,100mL/L马血清封闭剂、1∶50稀释的待检血清、0.625 mg/L HRP-家兔抗猪IgG酶标二抗(100μL/孔)及底物的反应时间分别为2.0、0.5、0.5h及15min;检测CSFV、伪犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性;4份血样进行5次板内、板间重复试验结果均一致;参照中和试验,本ELISA方法的符合率(97.9%)高于IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒(93.8%);福州市周边猪群BVDV抗体阳性率为34.7%,猪场阳性率为80.0%,其中母猪群阳性率(44.6%)高于商品猪群(26.4%)。结果表明,本ELISA方法特异性强、符合率高、重复性好,适合用于猪源BVDV的血清学监测。     

猪库布病毒纳米PCR快速检测方法的建立

为了给临床检测猪库布病毒(PKV)提供更加准确便捷的检测方法,本试验设计了1对特异性引物,扩增PKV基因组的VP0区域。在传统PCR反应体系中添加纳米金颗粒材料,优化后建立了一种方便快捷且特异检测PKV的nano-PCR方法。结果显示,该方法能特异性扩增猪库布病毒,与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒、猪轮状病毒、猪札幌病毒均无交叉反应。nano-PCR相对于普通PCR表现出更高的敏感性,普通PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-7ng/μL,而nano-PCR的最低核酸检测浓度为5.61×10^-10ng/μL,敏感性提高了1 000倍。对来自不同发病猪场30份腹泻猪的粪便和血液临床样本的检测结果显示,nano-PCR阳性检出率为23.33%(7/30),普通PCR阳性检出率为16.66%(5/30)。结果表明,本试验建立的nano-PCR方法在猪库布病毒的检测中表现出更高的特异性和敏感性,对猪库布病毒的快速诊断和检测具有重要的临床意义。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。