猪传染性胃肠炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组N蛋白免疫BALB/c小鼠,按照常规方法融合、筛选,最终获得2株抗TGEV N蛋白的杂交瘤细胞系,分别命名为2G7和2C2。2株单抗亚类均为Ig G1,腹水的间接ELISA效价均为1∶108。2株杂交瘤细胞连续培养20代,各代次的上清效价保持不变,均为1∶12 800,说明2株细胞分泌抗体的能力稳定。通过间接免疫荧光发现,制备的2株单克隆抗体能与感染TGEV的细胞发生特异性反应,在胞浆和细胞膜上有亮绿色荧光。结果表明,所制备的2株TGEV N蛋白的特异性单克隆抗体细胞株遗传稳定,分泌的抗体敏感性高,为TGEV病原检测奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白D位点单克隆抗体的制备和鉴定

通过大肠杆菌表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的D位点,并以D位点的六聚体作为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA筛选和3次有限稀释法进行克隆。结果显示,得到3株能稳定分泌抗TGEV S蛋白D位点单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2C104、5E1012和4B101,其中2C104和5E1012分泌抗体类型是IgM亚类,4B101为IgG1亚类。2C104、5E1012、4B101三株杂交瘤细胞培养上清液的间接ELISA抗体效价分别为1∶128、1∶128、1∶64,腹水效价分别为1∶103、1∶104、1∶4×103。间接免疫荧光鉴定结果表明,3株细胞均能和TGEV发生特异性反应,且在连续传代和冻存后仍能稳定分泌抗体。本研究针对S蛋白D位点制备了单克隆抗体,为传染性胃肠炎的诊断和TGEV与宿主互作机制的研究奠定了基础。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

鸭肠炎病毒单克隆抗体的制备

采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯鸭肠炎病毒 (DEV)鸭胚成纤维细胞适应毒 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0骨髓瘤细胞融合 ,经间接ELISA筛选 ,有限稀释法 3次克隆 ,获得了 2株稳定分泌DEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1B6和 2G8。经鉴定 ,2株单克隆抗体分别为IgM和IgG1 亚类 ,腹水ELISA效价均达到 1∶1 0 7以上。以 2G8单抗腹水为材料 ,采用间接免疫荧光抗体技术对DEV标准毒感染的鸭胚成纤维细胞进行检测 ,结果表明 ,用该抗体可特异性检出接毒后 6h感染细胞中的DEV ,且感染后 4 8h免疫荧光强度最高 ,该单抗与细胞成分和鸭肝炎病毒无交叉反应。将杂交瘤细胞冻存 3和 6个月 ,复苏后仍能稳定分泌单克隆抗体     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其应用

为制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)单克隆抗体(MAb)及其直接荧光标记抗体,本试验用纯化的牛病毒性腹泻病毒Ht01株免疫雌性BALB/c小鼠。间接ELISA测其血清效价,取抗体效价达标小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合。用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行2次亚克隆后注射入小鼠腹腔制备单抗腹水。利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水,用间接免疫荧光试验测定其活性,用SDS-PAGE试验测定其纯度。经活性、纯度检测合格后,采用搅拌法与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联;用葡聚糖G-25 Medium介质进行分离纯化。结果,本研究共获得2株能够稳定分泌IgG1类型的阳性杂交瘤细胞株和一种直接荧光抗体,分别被命名为BMAb11、BMAb20、DB11。稳定性试验表明,杂交瘤细胞分泌的抗体稳定性好。ELISA、间接免疫荧光试验和直接免疫荧光试验表明,单克隆抗体和直标荧光抗体均与BVDV发生特异性反应,说明它们的特异性较好。经ELISA鉴定,腹水抗体效价达到1∶12 800。直接荧光抗体荧光素与蛋白的摩尔比(F/P)为3.34,标准值在2.0～4.0之间,符合标准。上述研究结果表明,本研究制备的单克隆抗体和直标荧光抗体可用于BVDV的检测,为BVDV的临床诊断奠定了基础。     

抗禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)VR株CEF适应毒制备抗原,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术以间接ELISA筛选获得1株分泌抗AEV(VR)单克隆抗体的杂交瘤细胞.对制备的细胞上清及腹水进行单克隆抗体特性鉴定,经染色体计数、免疫球蛋白类及亚类测定、特异性试验、稳定性试验、SDS-PAGE电泳,表明该杂交瘤细胞染色体数目介于90-110条,该单克隆抗体亚类为IgG2a,分子质量为142 ku,ELISA测定细胞上清效价为11×104,腹水效价为11×106,与其它病原无交叉反应,抗体分泌稳定.     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与初步应用

利用提纯的禽脑脊髓炎病毒(AEV)Van Roekel株作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA法筛选,间接免疫荧光法(IFA)和免疫组织化学法鉴定,经3次亚克隆得到了稳定分泌抗AEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株F11和G2,制备了腹水,并利用该单克隆抗体初步建立了Dot-ELISA、间接ELISA和IFA等特异性检测AEV抗原的方法。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。