一株野生灰雁禽流感H9亚型病毒全基因序列的测定与分析

为研究新疆野生灰雁禽流感毒株的基因变异与演化,选择A/Grey goose/XJBZH/1/09(H9N2)株,应用RT-PCR对该毒株的8个基因片段进行了克隆、序列测定与分析。结果,该毒株的HA、NA、NS、M、NP、PB1、PB2和PA这8个基因的核苷酸序列长度分别为1 831、1 548、1 077、1 202、1 705、2 342、2 426和2 319bp。基因序列分析表明,该毒株的HA基因与鸡源毒株A/Chicken/Xinjiang/01/2010(H9N2)的同源率为99.3%;HA和NA基因与鸽源毒株A/pigeon/HongKong/WF53/03(H9N2)的同源率分别为91.5%和91.1%;HA、NA、NS和PB1基因与猪源毒株A/swine/Yangzhou/1/2008(H9N2)的同源率分别为97.5%、97.8%、96.9%和97.5%;NA基因与人源毒株A/Shaoguan/408/98(H9N2)的同源率为93.8%;M、NP、PA和PB2基因与所选的全部参考毒株的同源率均很低。遗传进化分析表明,A/Greygoose/XJBZH/1/09(H9N2)株属于欧亚种系,位于Y280-like亚群。     

欧洲禽源NA和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响

为探究欧洲禽源N A和M基因对重组猪流感病毒致病性的影响,通过对猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07(H 1N2)(S12)与A/swine/Zhejiang/1/07(H1N1)(Z11)进行测序以及基因型分析,确定了2009甲型H1N1流感病毒的PB 2、PB1、PA、HA、NP和NS基因均起源于三源重组H1N2亚型SIV(S12),NA和M基因均起源于欧洲禽源H1N1亚型SIV(Z11)。利用RT-PCR技术对Z11的NA和M基因分别进行扩增及克隆,以S12为骨架,成功拯救到含有欧洲禽源NA、M基因的重组病毒。通过检测不同病毒在MD CK、A549、PK15细胞上的生长特性,并以小鼠为模型对不同病毒的致病性进行了差异性分析。研究结果表明,欧洲禽源H1N1亚型SIV的NA和M基因相互协同地提高了病毒在体外多种细胞以及小鼠肺内的复制能力,增强了病毒对小鼠的致病性,这为甲型H1N1流感病毒的分子致病机制研究提供了理论依据,对猪流感的防控及预警具有重要意义。     

A型流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以A型流感病毒A/Chicken/Zhejiang/YH/2/2013(H7N9)的PB1基因为模板,扩增其1519～2274bp间的片段,并构建原核表达载体pET-28a(+)-H7N9-sPB1。通过大肠杆菌原核表达获得重组蛋白His-sPB1后,以其作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合筛选获得3株能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株5G5、2H3和5E8。Western-blot和IFA检测表明,3株单克隆抗体对于不同亚型的流感病毒均具有良好的反应性。免疫共沉淀结果表明,3株单克隆抗体能用于免疫共沉淀试验。A型流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备为进一步研究PB1蛋白的结构与功能以及流感病毒的监测与诊断提供了必要的工具。     

A型流感病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其亚细胞定位分析

以A型流感病毒A/Swine/Guangdong/(H3N2,H3病毒)株的基因组作为模板,扩增NS1基因并构建原核表达载体p ET-28a(+)-NS1。以大肠杆菌表达的NS1蛋白为抗原免疫小鼠,制备单克隆抗体,获得了2株分泌单克隆抗体细胞株2H9和3A4。IFA和Western-blot检测显示,抗NS1单克隆抗体与H3病毒感染的细胞有良好的反应性和特异性。亚细胞定位分析显示,H3N2病毒的NS1聚集于核仁处,H1N1病毒NS1聚集于核内周边,PR8毒株的NS1少部分在核内聚集、多数胞质呈颗粒状分布。流感病毒NS1单克隆抗体的制备为流感病毒流行病学监测、鉴别诊断及对其蛋白功能研究提供了工具。     

H1N1和H3N2亚型流感病毒基因芯片检测方法的建立

为建立同时能鉴别甲型H1N1和猪流感病毒常见亚型的新型基因芯片检测方法,根据GenBank中已发表的甲型流感病毒MP的基因序列和甲型H1N1(2009)和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型的基因序列,设计、筛选并合成7对特异性引物和1对通用引物;根据扩增的靶序列,设计并合成14条特异性探针和3条质控探针,制备了甲型H1N1(2009)流感病毒和猪流感病毒H1N1、H3N2亚型基因芯片;并进行了特异性试验、敏感性试验和田间样品的检测。结果显示,该芯片检测方法与猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等猪常见病毒无交叉反应;对猪H1N1、猪H3N2和甲型H1N1(2009)流感病毒而言,最低可检测到105、104和105稀释的病毒株。结果证实,该方法特异性强、敏感性高,是一种高通量的甲型H1N1和猪流感常见亚型筛查方法。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS基因的克隆及序列分析

采用RT PCR技术对4株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的NS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了4个毒株的NS基因阳性克隆。序列分析结果显示,分离毒株间的核苷酸同源率为90.2%～98.7%,氨基酸同源率为82.6%～97.8%。与其他毒株比较A Goose HLJ P46 2003(H5N1)和A Goose HLJ G2 2003(H5N1)株NS基因在第264～278位处发生了15个核苷酸缺失;A Goose Jilin W2 2004(H5N1)株NS1基因蛋白编码区的第652位碱基发生T C突变,成为终止密码子,造成NS1蛋白的C末端有13个氨基酸缺失。证实不同基因型的H5N1亚型禽流感病毒在我国家禽中同时存在;H9与H5亚型流感病毒基因间存在着广泛的遗传交换。     

野鸭源H3N8亚型禽流感病毒的系统进化和分子遗传特征分析

为了解在江苏某湿地野生水禽中分离到的1株禽流感病毒的来源、流行特点、进化和分子遗传特征,将采集的野生水禽粪便经处理后,使用A型禽流感通用荧光RT-PCR检测,阳性样品接种10日龄SPF鸡胚,收取接种后第24~96小时的尿囊液,进行血凝试验,随后对其进行全基因测序和遗传进化分析。结果显示,该毒株为H3N8亚型禽流感病毒,命名为A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)。HA蛋白的裂解位点氨基酸序列为PEKQTR↓GLF,无连续碱性氨基酸插入,符合典型低致病性禽流感病毒的特征;HA与NA的糖基化位点没有发生突变;NA耐药性氨基酸位点出现突变位点;PB2蛋白第627和701位氨基酸分别为谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(Asn),是禽源流感病毒的特征性氨基酸。在Gen Bank中对该毒株进行序列比对分析,结果显示,与所测基因片段同源性最高的10株毒株基本位于我国东部候鸟迁徙路线上。结果表明,A/Mallard/Xuyi/14/2015(H3N8)株为从江苏分离的低致病性禽流感病毒,基因主要来源于我国东部候鸟迁徙路线上的禽流感病毒。     

A型H1N1及H3N2亚型流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据A型H1N1亚型流感病毒2009年北美变异株和H3N2亚型流行株的基因序列,设计了3套特异性引物、TaqMan探针,分别用不同的荧光基团标记,以构建的A型流感病毒及H1N1和H3N2亚型流感病毒基因重组质粒作为阳性对照,经反应条件优化,特异性、敏感性和重复性试验,筛选出3套不同的反应体系及同一个反应参数,建立了可同时检测A型流感病毒、H1N1和H3N2亚型流感病毒的实时荧光RT-PCR方法。结果表明,该方法可特异地检测H1N1(人源、猪源)、H3N2(猪源),禽流感病毒H5、H9等A型流感病毒,且与新城疫病毒、减蛋综合征病毒等其他病毒不发生交叉反应,具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,试验耗时仅3h。表明,建立的方法,一次试验即可完成A型流感病毒的初筛和H1N1、H3N2亚型流感病毒的初步确认定型。     

禽流感病毒A/Turkey/Canada/63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒(AIV)A/Turkey/Canada/63毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段,并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明,该毒株的HA基因全长为1745bp,含有完整的阅读框架,编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp,编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示,该毒株HA基因属于H6亚型,NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析,表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80.5%～87.3%,氨基酸的同源性为88.0%～93.1%；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86.0%～93.5%,氨基酸的同源性为90.6%～96.3%。     

三株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株全基因的测序及遗传进化分析

为明确3株鸭源H9N2亚型禽流感病毒福建株A/Muscovy duck/Fujian/CL/1997(H9N2)(简称CL株)、A/duck/Fujian/MH/2003(H9N2)(简称MH株)和A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)(简称FQ2株)全基因组的分子特征和遗传进化情况,采用RT-PCR方法扩增这3株病毒全基因片段,并进行序列比较及遗传进化分析。结果表明,所克隆的8个基因片段均有完整的开放阅读框,其血凝素基因蛋白裂解位点的氨基酸组成为-RSSR*GLF-,为不连续的碱性氨基酸,其静脉接种指数远小于1.2,均符合低致病性AIVHA蛋白裂解位点特征;CL株和MH株的HA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系;FQ2株HA基因在遗传进化上属于DK/HK/Y280/97群系,3株H9N2亚型AIV HA基因在遗传进化上均属于经典的欧亚种系。3株H9N2亚型AIV NA基因颈部均存在缺失,CL株和MH株的NA基因在遗传进化上属于常见的CK/BJ/1/94群系,FQ2株NA基因在遗传进化上属于G1群系。CL株和MH株的其他6个基因在遗传进化上均和经典的CK/BJ/1/94一致,而FQ2株则可能是由不同流感病毒基因亚系间发生自然重排的产物。     

H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Shandong/1/02 分离株的基因序列分析

从有肺炎症状的病猪中分离到1株H9N2亚型猪流感病毒(SIV)A/Swine/Shndong/1/02,对其进行了全病毒基因序列分析.结果表明,该毒株8个基因片段的核苷酸序列均来自禽流感病毒(AIV),与我国目前家禽中流行的H9N2亚型AIV毒株具有很高的同源性,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)的同源性为94.1%～98.9%,与A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)的同源性为94.5%～98.2%;推导的其血凝素(HA)裂解位点处的氨基酸序列为P-A-R-S-S-R,完全符合H9亚型AIV欧亚分支中的类A/Chicken/Beijing/1/94亚分支的特征;基因分析结果表明,该分离株的所有基因片段均来源于H9N2亚型AIV,它可直接感染猪,并导致发病,但它并未在猪体内发生重组.     

鸭H5N1型高致病性禽流感的病理组织学观察

对发生H5N1型高致病性禽流感鸭场的鸭进行了病理组织学观察。结果显示 ,该养鸭场患鸭禽流感病鸭的剖检变化以眼结膜潮红出血 ,心肌白色条纹状坏死、条带样出血 ,胰腺有白色或透明坏死点 ,胃肠出血等为特征。组织学以非化脓性脑炎、胰腺坏死、心肌坏死、坏死性脾炎的病理变化为主。     

H5N1和H9N2亚型禽流感病毒型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的建立

采用禽流感病毒多克隆抗体及型特异性单克隆抗体,研究建立了型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5N1和H9N2亚型禽流感病毒。优化了反应条件,确定了包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,对该方法的敏感性、特异性、重复性及稳定性进行了分析,并与病毒分离鉴定的结果进行了比较。结果表明,该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于临床样品及鸡胚、细胞培养物中禽流感病毒的检测。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及表达

利用RT-PCR扩增了2株H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并将其克隆到pMD 18-T载体上,进行序列分析。结果显示,这2株禽流感病毒NS1基因核苷酸序列的同源性为70.2%,分别属于NS等位基因群A和等位基因群B。再将克隆的NS1基因插入到pET-28a质粒中构建原核表达载体,将其转化到DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞中,经双酶切鉴定及序列分析,表明获得了重组质粒pET-52NS1和pET-174NS1。经SDS-PAGE分析,重组质粒转化BL21(DE3)(pLysS)感受态细胞后,经IPTG诱导,获得了分子质量约为30 ku的NS1融合蛋白。用AIV多克隆血清做Western-blotting分析,发现来自2个等位基因群的NS1蛋白都具有较好的抗原活性。     

H5N1禽流感病毒感染雏鸭的病理学观察

通过眼观病变观察和组织病理学检查方法对H5N1禽流感病毒感染雏鸭的各器官组织病理变化进行了系统的研究,为H5N1禽流感病毒致病机制的研究及禽流感的-临床诊断提供理论依据.结果显示,雏鸭感染H5N1禽流感病毒后,除机体出现临床症状外,主要呈现明显的神经症状;病理剖检发现胰腺、肝、脾肿大,并见大小不一、数量不等的坏死灶;组织病理学检查发现全身各器官组织呈现出血、坏死和淋巴细胞浸润.经分析,多器官发生明显的细胞变性、坏死很可能是H5NI亚型禽流感病毒致病性的重要表现形式之一.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒(AIV)A/Goose/HLJ/p46/2003(H5N1)的NS1基因,将其克隆于融合蛋白表达载体pMAL-c2X上,转化DH5α大肠埃希氏菌感受态细胞,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定及序列分析,表明筛选到了重组质粒pc2X-NS1。SDS-PAGE电泳结果显示,重组质粒转化TB1大肠埃希氏菌后,经0.3mmol/L的IPTG诱导,融合蛋白MBP-NS1得到大量表达,融合蛋白以可溶形式存在,分子质量约为67ku。Western-blotting检测结果表明,融合蛋白MBP-NS1能够与H5N1亚型AIV活病毒感染康复鸭血清发生特异性反应,而不能够与H5N1亚型AIV灭活疫苗免疫鸭血清发生反应。试验初步建立了以纯化的融合蛋白MBP-NS1为包被抗原的间接ELISA检测方法,为AIV灭活疫苗免疫家禽与AIV感染家禽的鉴别诊断奠定了基础。     

武冈市H5N1型禽流感的诊断与流行病学调查

20 0 4年 1月 2 4日 ,湖南省武冈市家畜疫病防检站接到该市某孵化兼养鸭专业户张某报告 ,称其所饲养的 4 30 0只鸭 ,从 1月 2 0日起陆续死亡 ,已达 130 0只。为了解病鸭发病、死亡原因 ,进行合理的疫情处理与科学防治 ,笔者进行了临床诊断、病理剖检、实验室检验和流行病学调查。1　发病情况该专业户于 2 0 0 3年 10月 1日开始从事鸭苗孵化 ,并从孵化的鸭苗中留种饲养。 2 0 0 4年 1月 2 0日 ,该群鸭开始出现发病、死亡 ,至 1月 2 4日 ,其所饲养的 4 30 0只鸭有 330 0只发病 ,死亡 130 0只 ;发病率为 76 .7% ,病死率为 39.4 %。2　临床症状…