牛朊蛋白单氨基酸变异体的原核表达

应用pGEX原核表达载体构建了牛朊蛋白的1个正常重组蛋白和3个单氨基酸变异体的原核表达质粒,即pGEX BoPrP(93~241)、pGEX BoPrP(93~241)(S154N)、pGEX BoPrP(93~241)(A129V)和pGEX BoPrP(93~241)(Q234R)。经转化E.coli BL21 (DE3),均表达了预期大小约为42.4 ku的融合蛋白。在优化的诱导表达条件下,各重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%~45%的融合蛋白。经免疫印迹检查,所有融合蛋白均可与抗牛单克隆抗体4C11 反应。表明,单氨基酸突变并不影响单抗4C11的识别表位。     

麋鹿朊蛋白全基因的克隆及序列分析

为获得中国麋鹿朊蛋白(PRNP)的全基因,并利用DNAStar软件与已报道的其他动物的朊蛋白全基因序列进行同源性分析,根据GenBank中马鹿朊蛋白基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从提取的总基因组中扩增得到麋鹿PRNP基因;将其连接到pGEM-T Easy载体中,获得克隆产物并测序。结果,成功扩增出了中国麋鹿PRNP基因,构建了重组质粒pGEM-T-ML;对克隆产物的序列分析表明,麋鹿PRNP基因的开放阅读框包含771bp,编码256个氨基酸的前体蛋白,前体蛋白的分子质量约为28 200u;与已报道的其他鹿科动物朊蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98.8%以上,与几种非鹿科动物的同源性在96.5%～98.4%之间。结果表明,麋鹿PRNP基因的核苷酸和编码蛋白的氨基酸序列与其他鹿科动物的序列具有高度保守性,而与几种非鹿科动物间的同源性也较高,说明朊蛋白是一种古老的高度保守的蛋白。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白(PrPc)基因。测序分析表明,所克隆的羊PrPc基因片段大小为771 bp,包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列,其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21(DE3),挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达,收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明,PrP基因在大肠杆菌中成功表达,并能被抗牛PrPc单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%~45%,目的蛋白以包涵体的形式存在,包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

番鸭呼肠孤病毒YB株NS基因的序列分析及原核表达

为实现番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株NS非结构基因的克隆分析及原核表达,首先经RT-PCR扩增NS基因的完整编码序列(CDS),并将其克隆到p ET-32a(+)载体中。测序后对获得的NS基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,进行IPTG诱导表达及条件优化。对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。测序结果显示,成功构建了包含MDRV-YB株NS基因的原核重组质粒p ET-YB-NS,并获取了NS基因序列。序列分析结果显示,MDRV-YB NS基因的CDS大小为1 908 bp,编码635个氨基酸;该基因核苷酸序列与传统MDRV的同源性为98.2%~99.4%。遗传进化树分析显示,MDRV-YB株处于传统型MDRV分支上。该蛋白氨基酸序列中并不含有潜在的信号肽序列,但是含有2个潜在的N-糖基化位点以及61个磷酸化位点。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析显示,成功高效表达出分子质量约为88.7 ku的融合蛋白(p-NS),表达时IPTG最佳诱导时间、浓度和温度分别为5 h、0.4 mmol/L和36℃。Western-blot结果显示,表达的p-NS蛋白能特异性识别MDRV阳性血清,表明表达产物具备良好的反应原性。上述结果表明,MDRV NS非结构基因的克隆分析及其蛋白表达的实现,为进一步研究MDRV NS蛋白功能奠定了基础。     

牦牛和双峰驼重组朊蛋白的原核细胞表达

应用重组DNA技术构建了牦牛和双峰驼重组朊蛋白的4个表达载体,即pGEX-BoPrP(23~242)、pGEX-BoPrP(100~242)、pGEX-CaPrP(25~241)和pGEX-CaPrP(93~241),经转化E.coliBL21(DE3),成功地获得了重组菌E.coliBoPrP(23~242)、E.coliBoPrP(100~242)、E.coliCaPrP(25~241)和E.coliCaPrP(93~241),分别可表达大小约为50.2、41.7、49.9和42.4ku的融合蛋白。各重组菌经1.0 mmol/L的IPTG于37℃诱导5~6 h可产生占细菌总蛋白量30%~45%的融合蛋白。免疫印迹分析表明,除融合蛋白GST-BoPrP(100~242)外,GST-BoPrP(23~242)、GST-CaPrP(25~241)和GST-CaPrP(93~241)均可与抗牛单克隆抗体4C11反应,显示中国黄牛PrPC与牦牛和双峰驼PrPC具有共同的抗原成分。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白D15基因的原核表达及其表达产物的免疫原性

根据GenBank中登录的副猪嗜血杆菌(HPS)D15基因鸟枪序列(登录号:NZ_ABKM01000005)设计1对特异性引物,以HPS5型SP毒株DNA为模板,通过PCR方法扩增了D15基因。将其进行T-A克隆,构建pMD18D15质粒并进行序列测定和分析。结果表明,D15基因含有一个2418bp的开放阅读框,编码805个氨基酸,与D15基因参考序列的同源性为99.9%。该HPSD15基因的推导氨基酸序列具有典型Omp85蛋白家族的拓扑结构特征。以pMD18D15质粒为模板,用PCR方法扩增HPSD15基因,并将其克隆到pET-28a(+)中,构建pETD15原核表达质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后,用IPTG诱导重组菌,并用SDS-PAGE和Western-blot检测诱导物。结果表明,pETD15重组表达质粒在大肠杆菌中实现了高效表达,融合蛋白的分子质量约为94ku,融合蛋白能被HPS阳性血清识别,提示该融合蛋白具有反应原性。昆明小鼠和豚鼠免疫试验结果表明,D15重组蛋白具有一定的诱导免疫保护反应的能力。     

鸡朊蛋白的原核表达及其抗血清的制备

运用分子生物学方法分别构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)和IPTG诱导表达,并对融合蛋白诱导表达时间、IPTG浓度进行优化,诱导表达的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白经GST-trap FF柱亲和层析纯化,用纯化后的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白免疫新西兰雄兔,以探究鸡朊蛋白的结构与功能。结果表明,本试验成功构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达菌,SDS-PAGE分析结果显示,得到大小为50、42和32ku左右的融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)、GST-ChPrP(174～247),与预期结果基本相符,在最适条件下每升pGEX-4T-ChPrP1菌液通过GST-trap FF层析柱获得的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白达10mg,制备的抗血清经琼脂糖凝胶扩散试验检测到较高的多克隆抗体效价(1∶32);Western-blot分析结果显示,融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)及鸡脑组织蛋白均可与该抗血清发生特异性免疫反应。证实,鸡重组朊蛋白具有良好的抗原性,与鸡脑组织朊蛋白具有相同的抗原成分。     

双峰驼朊蛋白基因的克隆和序列分析

分别从4峰双峰驼全血中提取基因组总DNA,用所设计的引物扩增了细胞型朊蛋白(PrP)基因,并克隆到pMD 18-T载体。序列分析表明,所克隆的4个双峰驼PrP基因片段大小分别为768、768、792和795 bp,包含了朊蛋白基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框,均与国外报道的同属单峰驼PrP序列基本相同。4个双峰驼PrP基因含5个或6个短而富含G-C的元件,可编码5个或6个八肽(九肽)重复序列Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln或Pro-Gln/His-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln,其氨基酸序列含有24个氨基酸的N-端信号肽和22个氨基酸(除LT200302为23个氨基酸外)的C-端信号肽。4个双峰驼PrP基因之间相比较,其核苷酸和推导氨基酸序列的同源性为91.0%~100.0%和94.2%~100.0%。共发生133个碱基替换,其中107个为同义码替换,26个为异义突变。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

边缘无浆体MSP5蛋白基因的克隆及原核表达

参照已发表的边缘无浆体主要表面蛋白5(MSP5)基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增获得了MSP5蛋白基因。将其克隆到pGEM-T Easy载体,并进行测序分析。结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5蛋白基因的序列同源性达98.6%,编码氨基酸的同源性为99.0%,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633 bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5α宿主菌中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达,表达产物的分子质量为45 ku。Western-blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。     

朊毒体蛋白的构象及其特性的研究进展

概述了朊毒体(包括构象不同的细胞型朊毒体和痒病型朊毒体)蛋白的构象特征、朊毒体及其突变体的特性,阐明了PrPsc是由PrPc通过构象转变而成的,不同物种PrP的三维结构有相似的球形结构域(125~228位)和N-末端无规卷曲尾,其球形结构域均由3个螺旋(144~154、173~194和200~228位)以及1对反平行的β-折叠(128~131和161~164)组成,但其结构和表面电荷分布存在一些区别。     

脂筏标记蛋白flotillin-2生理功能的研究进展

为了给进一步研究flotillin-2与某些神经退行性疾病(如海绵状脑病等)的关系提供参考,对脂筏标记蛋白flotillin-2的结构及其主要的生理功能进行了综述,提出,进一步研究flotillin-2与某些神经组织退化疾病及肿瘤的关系,对疯牛疯、克雅病、阿尔兹罕默氏病以及肿瘤病的发病机制及治疗研究具有重要意义。     

传染性羊痒病抗性基因分型方法的建立

根据GenBank中登录的绵羊朊蛋白编码基因PRNP序列,设计并合成了可用于单核苷酸多态性(SNP)快速分析的3对引物和7条分别标记了FAM和VIC荧光染料的MGB探针,建立了一种利用荧光定量PCR扩增反应对羊痒病抗性基因进行筛选的方法。结果表明,设计的引物及探针具有特异性和高效扩增性,能够用于PRNP羊痒病抗性基因的快速分型。借助该方法可建立一整套完善的预警监测体系来预防该病的发生,也可用于羊痒病的常规实验室诊断。     

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。     

PrP基因在金黄地鼠淋巴和外周组织中表达水平的动态检测

利用实时荧光定量RT-PCR技术,构建了标准重组质粒,制备了标准曲线,对不同年龄金黄地鼠腹股沟浅淋巴结、脾、心、肝、肺和肾提取总RNA,反转录后进行PrP基因的表达定量。结果发现,淋巴组织呈现高的表达量,外周组织的表达量比较低;不同组织在不同年龄出现表达高峰。