几种动物病毒的基因芯片检测技术

分别用水疱性口炎病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、鹿流行性出血热病毒和赤羽病病毒各一段高度保守的基因片段构建质粒 ,在此基础上制备了芯片探针。提取样品中的核酸 ,经反转录和荧光标记后滴加到芯片上进行特异性杂交 ,对杂交结果扫描检测 ,可同时对上述 7种动物传染病进行快速、准确的诊断 ,此方法敏感性高 ,特异性强 ,适合于大批动物高通量检疫。     

FMDV在BHK_(21)细胞扩增后FMDV140S抗原的测定

本文报告了用蔗糖密度梯度离心和光密度分析相结合口蹄疫 病毒(FMDV)在单层BHK_(21)细胞中扩增后,其中FMDV 140 S抗原浓度,并同时分析了经BEI(二乙烯亚胺)灭活后,这种抗原含量的改变。结果表明,O型FMDV在单层BHK_(21)细胞中增殖后,其FMDV 140 S抗原浓度达1.2μg/ml;而经BEI灭活后,其中FMDV 140 S抗原浓度降至0.9μg/ml。     

五种重要猪病病毒基因芯片探针的建立及其应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病痛毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)的特异cDNA片段作为探针点制于氨基修饰的玻片上,以这5种细胞毒的核酸作为模板,进行不对称PCR扩增,制备靶物,经绿色荧光染料Cy3标记后,分别与cDNA微阵列的芯片探针进行杂交,杂交信号经Genepix 4000A扫描仪扫描.结果显示,该芯片探针可以特异地与Cy3标记的这5种靶物结合.用该基因芯片对100份现地采集的猪全血样品进行检测,检出PRRSV阳性样品26份,PCV-2阳性样品47份,PRRSV和PCV-2混合感染阳性样品17份,PPV阳性样品5份,PRV阳性样品2份,CSFV阳性样品20份.表明,本试验研制的cDNA芯片探针可以特异地检测这5种猪病病毒,具有良好的诊断应用前景.     

禽流感与新城疫二联RT-PCR诊断方法的建立及其应用

根据禽流感病毒 (AIV)、新城疫病毒 (NDV)基因组序列高度保守区 ,设计合成了 2对引物 ,以AIV、NDV培养物提取RNA并反转录 ,进行RT PCR特异性片段扩增 ,扩增的片段大小分别为4 70和 32 0bp。结果 ,扩增产物与设计的 2对引物之间的序列大小一致。通过特异性与敏感性试验 ,AIV、NDV培养物均可扩增至 1 0 - 4,表明本方法对 2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点     

LncRNA9606对猪流行性腹泻病毒复制的影响

长链非编码RNA(lncRNA)是一种长度大于200 nt的非编码RNA分子,在调节多种生命活动中起着重要作用。本团队前期研究发现,宿主的lncRNA表达谱在猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染后发生显著变化。本研究选择其中一条差异表达的LncRNA TCONS_00009606(LncRNA9606),以研究它对PEDV复制的影响。为此,本研究首先检测LncRNA9606在PEDV感染后不同时间点的动态表达变化。结果,PEDV感染显著上调LncRNA9606的表达。随后对猪肠上皮细胞、派伊尔氏淋巴集合结以及外周血单个核细胞中LncRNA9606的表达丰度进行了分析,结果显示派伊尔氏淋巴集合结和外周血单个核细胞中的LncRNA9606含量显著高于小肠上皮细胞系细胞,并主要定位于细胞核中。在LLC-PK1细胞中过表达LncRNA9606后,PEDV复制水平显著降低。由此可见,LncRNA9606可在LLC-PK1细胞中抑制PEDV病毒的复制。     

鸭黄病毒AH01株的分离与鉴定

为查明2010年10月以来安徽望江等地的蛋鸭相继暴发的以产蛋量大幅下降为特征的传染病的病因,进行了病毒分离、特异性目的基因片段扩增和动物回归试验。结果显示,分离毒(命名为AH01株)能致死鸭胚和鸡胚,不具有血凝性。对病料和接毒鸭胚尿囊液进行RT-PCR,可扩增出基因片段,其核苷酸序列与鸭黄病毒BYD-1株的相似性为94.1%。用鸭胚分离毒接种300日龄蛋鸭,能够复制出产蛋量下降病例。分析表明,分离毒为鸭黄病毒,该病毒是引起此次鸭病疫情的病原。     

五种禽呼吸道病病原多重PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)和鸡毒支原体(MG)的基因序列,设计了5对特异性引物,建立了分别针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断方法,并进行了退火温度、引物浓度和TaqDNA聚合酶浓度的优化,以及特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明,设计的5对引物对同一样品中的RNA(AIV、NDV、IBV)和DNA(ILTV、MG)进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp(AIV)、321bp(NDV)、457bp(IBV)、662bp(ILTV)和732bp(MG);建立的多重PCR方法具有较强的特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pgIBV的RNA和1pgILTV、10pgMG的DNA。对鸡临床样品的检测结果证明,该方法在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

盒式超滤系统对四联苗中NDV及IBV的浓缩试验

采用Filtron中型盒式超滤系统,对新城疫病毒(NDV)抗原液和NDV与传染性支气管炎病毒(IBV)混合抗原液进行浓缩试验.结果显示,浓缩抗原液的HA效价按浓缩比率成倍上升,而超滤液的HA为阴性.以浓缩抗原液、未浓缩抗原液及超滤液为水相,分别制成NDV浓缩油苗、NDV未浓缩油苗、四联浓缩苗、四联未浓缩油苗以及超滤液乳剂,分别对鸡免疫后,NDV浓缩苗与未浓缩苗免疫鸡均产生了对NDV强毒攻击的抵抗力,保护率达100%,而NDV浓缩苗诱导产生的HI抗体效价明显高于未浓缩苗;比较浓缩四联苗与未浓缩四联苗的免疫效力,当2种疫苗注射剂量不同而抗原量相同时,诱导产生的免疫效力相同;浓缩苗与未浓缩苗效价测定及超滤液乳剂免疫试验结果证实,浓缩过程中既无有效抗原丢失,也无抗原活性变化.试验结果显示,该设备浓缩工艺简单,抗原回收率达100%,是一种理想的病毒浓缩设备.     

孔雀暴发传染性支气管炎的调查

上海市某孔雀养殖场繁殖的4000多只孔雀,其中1600多只暴发了以呼吸道症状为主要特征的传染病,继而病孔雀因腹泻、迅速消瘦死亡1000多只.经初步对分离病毒株进行实验室鉴定,病原为肾型传染性支气管炎病毒.从孔雀体内分离出该病毒,在国内较为罕见.     

应用三重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡3种病毒性呼吸道传染病的研究

根据鸡新城疫病毒(NDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因文库,设计了3对分别与NDV、IBV和ILTV某段基因序列互补的引物.用这3对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV核酸模板进行三重PCR扩增,结果均同时得到了3条与设计相符的310 bp(NDV)、1720 bp(IBV)和647 bp(ILTV)三重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该三重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和10 pg的ILTV DNA模板.     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古株的分离与观察

以内蒙古某羊场自然感染绵羊肺腺瘤病的病肺组织 4例和 3月龄绵羊胎肺 2例作为材料 ,对胎肺细胞进行了原代培养并接种绵羊肺腺瘤病毒悬液 ,进行了绵羊肺腺瘤病毒 (JSRV)的分离 ,同时采用电镜负染色技术和超薄切片透射电镜技术对上述样品进行了观察。结果表明 ,自然感染绵羊肺腺瘤病的 4例病肺组织中都有散在的病毒粒子 ,其直径为 10 0～ 12 5nm ,接种病毒悬液的胎肺细胞从第 2代到第 9代均出现细胞病变 ,但对绵羊胎肺培养的病毒悬液电镜负染色观察未发现典型的病毒粒子 ,而超薄切片透射电镜观察发现了病毒样粒子     

表达狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒在犬体内的免疫效果

为研制一种新型有效的狂犬病重组活载体疫苗,将EGFP-rgp的表达框克隆入p8-AA载体的Sph Ⅰ/Nde Ⅰ酶切位点处,将酶切鉴定为正向连接的阳性重组子命名为p8AA-EGFP-rgp.在质脂体介导下将该质粒与Bartha-K61共转染PK-15细胞,获得能够表达狂犬病病毒(RV)CVS-11株糖蛋白的重组伪狂犬病病毒rPRV/EGFP-rgp,经RT-PCR和Western-blot鉴定后对犬进行肌肉注射免疫,并测定相应试验指标,研究重组病毒对犬的免疫诱导情况.结果显示,重组病毒可以有效地刺激机体产生体液免疫和细胞免疫;产生的针对RV的中和抗体水平[(0.95±0.21)U/mL]在14周时还保持相对国际最低保护标准(0.5U/mL)较高的水平;且产生的针对RV和PRV的中和抗体水平均达到了相应灭活疫苗和减毒活疫苗的水平,抗体效价均维持在14周以上.     

尼帕病毒病及其病原的研究进展

概述了尼帕病毒病在国外的流行状况、尼帕病毒(Nipah virus,NiV)的变异及我国的研究现状,着重阐述了近年来在其基础病毒学、诊断技术及防治方面的研究进展,主要包括病毒蛋白的功能及其相互作用、受体的发现、动物模型、荧光PCR及ELISA诊断技术、抑制NiV感染及治疗等方面的研究成果,为该病的深入研究提供了参考。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株TK基因的分离鉴定

提取伪狂犬病病毒(PRV)Bartha-K61株基因组DNA,用限制性内切酶KpnⅠ充分消化,回收5.9×103b片段(J片段),将其克隆于质粒pUC119 KpnⅠ位点上,获得pBKJ.用一对针对PRV TK基因的特异性引物对重组质粒进行PCR鉴定,证明其中含有PRV TK基因.然后用KpnⅠ、PstⅠ和BamHⅠ等限制性内切酶对其进行酶切分析,确定了克隆片段的物理图谱.进一步研究证实TK基因位于其中的KpnⅠ-BamHⅠ或KpnⅠ-Pst Ⅰ片段中.然后亚克隆此KpnⅠPstⅠ片段,并进行了序列测定.     

日本脑炎病毒复制及感染影响因素的研究进展

日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）是一种蚊媒传播的自然疫源性人畜共患传染病,对世界养猪业造成了重大经济损失,还能感染人类。日本脑炎简称“乙脑”,其病原为日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）,是动物疫病防控中最重要的传染病之一。目前,防控JEV的有效措施为生物预防及疫苗免疫。然而,由于JEV存在猪-蚊-人的传播途径,给该病的防控带来严峻挑战,现有的JE商品疫苗只能对动物机体提供部分保护。目前也无有效的抗JEV的药物,抗JEV的有效药物开发成为研究的热点。基于此,本文对影响JEV复制与感染的各类因素的最新研究进展进行综述,以期为开发高效防制JE的新型药品提供参考依据。     

水禽3种免疫抑制性病毒多重PCR检测方法的建立与应用

禽流感病毒 H9 亚型(AIV-H9)、鹅圆环病毒(GoCV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)是水禽常见病原,常发生混合感染且易导致水禽的免疫抑制性疾病。 本研究针对 AIV-H9、GoCV 和 MDRV 的基因序列,分别设计特异性引物,通过优化多重 PCR 的反应条件,建立了这 3 种病毒的多重 PCR 检测方法,并进行特异性、灵敏度和可重复性验证。 结果显示,建立的三重 PCR 检测方法能特异性扩增 AIV-H9、GoCV 和 MDRV的目的片段,与新型鹅星状病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒 4 型无交叉反应;最低检出浓度分别为2.93×10⁴copies/ μL、2.5×10²copies/ μL、3.0×10⁶copies/ μL;利用该方法对 30 份临床样品进行检测,MDRV检出率为 6.7%,GoCV 和 AIV-H9 的检出率较高,分别为 36.7%和 26.7%。 三重 PCR 与单重 PCR 的符合率为 100%。 结果表明,该三重 PCR 检测方法特异、灵敏、稳定性好,能够用于这 3 种病毒的流行病...     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

病毒受体及其研究进展

介绍了病毒受体的基本生物学特性,重点阐述了噬菌体展示、免疫共沉淀及酵母双杂交等病毒受体研究方法,综述了几种重要动物病毒细胞膜受体的研究进展,并对病毒受体研究的发展前景进行了展望。