伪狂犬病病毒gB抗原的可溶性原核表达及纯化条件的优化

为实现伪狂犬病病毒gB蛋白的可溶性表达,基于伪狂犬病病毒gB基因的序列分析及密码子优化,基因合成gB基因胞外区(含全部抗原表位)序列,亚克隆至原核表达载体pSMK中,获得表达载体pSMKgB。经大肠杆菌诱导表达,并对诱导温度、可溶性、IPTG加入时机、终浓度及诱导时间进行优化。结果表明,伪狂犬病病毒的gB蛋白在16℃、D600值为1.2、IPTG终浓度为0.8mmol/L的条件下,诱导20h,蛋白表达效果最好。经超声破碎,镍柱纯化可获得可溶性的gB蛋白。蛋白印迹法分析结果表明,纯化的目的蛋白能与抗组氨酸标签的抗体及猪伪狂犬病病毒阳性血清发生特异性反应,证实表达的蛋白具有较好的反应原性。本研究为后期制备猪伪狂犬病血清检测ELISA试剂盒奠定了基础。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA ,根据已报道的猪瘟病毒基因组序列 ,设计合成了 2对引物 ,以总RNA为模板 ,利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、套组聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术 ,对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的 5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定 ,用DNAstar软件比较分析了 5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株 (C ST株 )E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现 ,5株野毒与C ST株核苷酸序列的同源性为 81.7%～ 83.1% ,氨基酸同源性为 87.3%～ 88.6 % ,表明它们之间存在较大的差异 ;但 5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达 98.8%～ 99.3% ,氨基酸同源性为96 .6 %～ 99.2 % ,表明它们之间的差异较小     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3′非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列。测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基。经与参考毒株进行序列比较,结果显示,HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%。同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较。结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域。     

含74个腺嘌呤poly(A)尾的猪水泡病病毒HK/70株3''''非编码区的克隆及其特征分析

应用3′RACE法降落式扩增并克隆了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株基因组3′端的真实序列.测序结果表明,所扩增的目的基因片段长4 200 nt,包括非结构蛋白编码区(P2和P3)、3′端非编码区和poly(A)尾,其中3′NTR位于终止密码子TAA之后,长99 nt,poly(A)至少含有74个腺嘌呤碱基.经与参考毒株进行序列比较,结果显示, HK/70株与J1′73、H/3′76和AUG/22/90株的核苷酸同源性较高,为99.0%(仅第65位碱基不同),而与NET/1/92参考毒株的核苷酸同源性较低,为83.3%,与人柯萨奇病毒B5 UK/54株(UK/54-CB5)的同源性为75.7%.同时对3′NTR的二级结构进行分析,并与参考毒株和CB5毒株的二级结构进行了比较.结果表明,它们具有协同变异性,有共同的祖先,显示出3′NTR存在支持其功能所必需的一些结构域.     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。     

瘟病毒致细胞病变的遗传机制及其非结构蛋白的功能

牛病毒性腹泻 黏膜病病毒 (ｂｏｖｉｎｅｖｉｒａｌｄｉａｒｒｈｅａ ｍｕｃｏｓａｌｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ ,ＢＶＤＶ)、边界病病毒 (ｂｏｒｄｅｒｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ ,ＢＤＶ )以及猪瘟病毒 (ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ ,ＣＳＦＶ )在黄病毒家族中构成了瘟病毒属 (Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ)。瘟病毒是能够引起畜牧业严重损失的重要病原。这些具有囊膜的病毒粒子内包含长为9.5～ 12 .3ｋｂ的单股正链ＲＮＡ ,其基因组包含有长的开放阅读框架 ,在病毒或细胞蛋白酶的作用下 ,通过共翻译或翻译后修饰途径产生成…     

佐剂及其在基因免疫研究中的应用

论述了免疫佐剂的作用机理及细胞因子、CpGDNA、化学佐剂、共刺激信号分子、化学因子、黏附分子等佐剂在基因疫苗中的应用概况,并对免疫佐剂在基因疫苗中的应用前景进行了展望。     

大肠埃希氏菌表达猪瘟病毒E2蛋白的纯化

采用 pPROEX HTB融合蛋白表达系统 ,将猪瘟病毒E2 基因与 6×His的编码序列在大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)中进行融合表达 ,表达蛋白质主要以包涵体形式存在。用 8mol/L尿素溶解包涵体后 ,利用镍离子金属螯合亲和层析法纯化蛋白。结果 ,在SDS PAGE上显示出一 17ku的目的蛋白条带 ,纯度达到 90 %以上。纯化后的蛋白变性、复性处理后能与猪瘟阳性血清发生特异性结合     

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。     

益于猪圆环病毒2型增殖的PK-15细胞系的克隆筛选与应用

通过有限稀释法对被猪圆环病毒2型(PCV2)感染的PK-15细胞进行2轮细胞克隆筛选,得到1株对PCV2高度易感且稳定的同源性PK-15细胞克隆株,以提高PCV2在PK-15细胞系中的感染效价。结果显示,利用间接免疫荧光试验(IFA)从成功获得的7株PK-15细胞克隆株中筛选得到3株荧光反应较强的PK-15细胞克隆株。通过IFA、半定量PCR和Western-blotting等方法确定PCV2可以在PK-15细胞克隆株2中高效克隆并表达PCV2 Cap蛋白。QPCR结果表明,PCV2感染该PK-15细胞克隆株后第48小时病毒表达量达到最高。这证实,获得的高敏感性PK-15细胞克隆株2可用于持续产出高效价的PCV2以便于相关疫苗和诊断制剂的研制。