PCV2 PPV PRV和PRRSV多重PCR检测方法的建立及初步应用

参照GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因序列,设计了4对引物分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV gB、PRRSV N基因的目的片段.通过对反应因素进行优化,建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR(mPCR)诊断方法.敏感性和特异性结果显示,该mPCR对4种病毒的最低核酸检测量分别为29.0 Pg(PCV2)、17.3 pg(PPV)、36.8 pg(PRRSV)、38.4 Pg(PRV),而对猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒1型、牛病毒性腹泻黏膜病病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性.119份临床样品的多重PCR检测结果显示,有3份样品同时感染PPV和PCV2,68份样品同时感染PRRSV和PCV2,其余样品均为PCV2阳性.表明,建立的多重PCR方法能够对PCV2、PPV、PRV、PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断.     

猪圆环病毒3型RAA检测方法的建立及初步应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)的快速简便检测方法,根据PCV3 Cap基因的保守序列设计多对引物和探针,建立了一种实时荧光RAA检测方法。通过筛选引物和优化试验条件,验证对常见动物疾病病毒的特异性,并与PCR方法在敏感性上进行比较。结果表明,PCV3与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪A型塞内卡病毒(SVA)和口蹄疫病毒(FMDV)等核酸无交叉反应,可在39℃下20 min内快速特异完成。该方法灵敏度较高,最低检出浓度为10~2copies/μL。应用该方法对115份猪临床样品进行检测,检测结果与PCR方法一致。结果表明,该方法操作简单、快速灵敏、结果可靠,可用于PCV3的实验室检测和现场诊断。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝.分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性.表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测.     

非洲猪瘟病毒LFD-RPA快速检测方法的建立

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)B646L基因保守序列设计nfo RPA特异性引物和探针,建立了ASFV核酸LFD-RPA快速检测法。结果表明,该方法特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等病原核酸无交叉反应;最低可以检测到1.57×10~2copies/μL重组质粒pUC-B646L;检测时间短,其中RPA扩增20 min,LFD检测10～20 min。应用该法及OIE推荐的荧光PCR法对24个模拟样品进行检测,检测结果一致。对50份已知的临床样品核酸进行检测,阳性符合率为73.3%。上述结果表明,本研究建立的LFD-RPA快速检测方法操作简便,为ASFV现场快速检测提供了技术支持。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。     

四种猪呼吸道疾病综合征病原多重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、胸膜肺炎放线杆菌(APP)和猪肺炎支原体(M.hyo)的多重PCR方法,分别针对PRRSV的ORF1a基因、PCV2的ORF2基因、APP的OMLA基因和M.hyo的P46基因的保守区域设计4对特异性引物,优化反应体系及条件,建立了可同时扩增PRRSV(225bp)、PCV2(337bp)、APP(107bp)、M.hyo(176bp)相应基因的四重PCR方法。结果显示,该方法能单管同时特异地鉴别检测PRRSV、PCV2、APP、M.hyo 4种病原体,对猪瘟病毒、副猪嗜血杆菌、猪呼吸道冠状病毒、猪流感病毒、猪细环病毒及猪细小病毒等无特异性扩增,说明该PCR具有良好的特异性;方法的灵敏度分别为195、272、241、321pg/μL。应用该方法对重庆市的61份样品进行检测,其中PRRSV、PCV2、APP、M.hyo的阳性率分别为22.9%(14/61)、18.0%(11/61)、8.2%(5/61)和18.0%(11/61)。该方法的建立为临床上4个病原的快速鉴别诊断提供了有力的技术手段。     

猪主要免疫抑制性疾病四重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测猪巨细胞病毒(PCMV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细环病毒(TTV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的四重PCR检测方法,本研究设计合成了4对特异性扩增引物,在系统性地优化反应体系、反应条件的基础上,分别对其特异性和敏感性进行验证,建立了能够快速检测以上4种病原的多重PCR方法,并对131份临床样品进行了检测。结果显示,该检测方法特异性好,灵敏度高,对PRRSV、PCV2、TTV和PCMV的最低检出量分别为2.4×10~3copies/μL、3.5×10~5copies/μL、6.2×10~2copies/μL、5.6×10~3copies/μL。以单一PCR方法对所有临床样品进行检测后发现,检测结果与多重PCR检测结果一致,证明该多重PCR方法可以用于这4种病原的快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流行性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

为快速简便地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV),根据GenBank中已发布的基因序列,选择PRRSV的ORF7基因和PEDV的S基因,分别设计1对特异性引物,通过对反应体系中各成分的优化,建立了可同时检测PRRSV和PEDV的双重RT-PCR方法。本方法能从PRRSV和PEDV的混合基因组中分别扩增出300 bp和578 bp的特异性片段,且对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、乙型脑炎病毒、轮状病毒、大肠杆菌的扩增结果均为阴性;应用该方法对采自成都周边的79份临床样品进行检测,结果与单一RT-PCR的检测结果一致,具有良好的重复性;本方法检出的最小拷贝数为1.49×10~5copies/μL,敏感性也较好。本研究建立的双重RT-PCR方法具有较好实用性,可用于临床样品的检测。     

猪生殖与呼吸综合征病毒的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR检测

根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白基因核酸序列设计引物,经BLAST比较发现,该引物既可以扩增较早发现的PRRSV毒株,也可以扩增近期发现的在Nsp2基因上有较大变异的PRRSV毒株,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为标准品建立了检测PRRSV的SYBR Green-Ⅰ荧光定量PCR方法.结果表明,该方法标准曲线的相关系数大于0.99,敏感性可以达到1×101拷贝/μL,约为普通PCR的100倍;用该方法检测人工感染PRRSV的猪全血,结果阳性检出率为100%.敏感性、特异性和稳定性试验表明,该方法具有很高的敏感性、特异性和稳定性,可以用来快速检测PRRSV.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型双重荧光PCR检测方法的建立

为建立快速简便检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本研究根据GenBank中已登录的PRRSVORF7基因序列和PCV2 ORF1基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PRRSV和PCV2的双重荧光PCR方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PRRSV和PCV2的灵敏度分别可达1.05 TCID_(50)/100L和6.30 TCID_(50)/100μL,表明,本试验建立的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PRRSV和PCV2进行快速诊断,适合现场检测,为这两种疫病的诊断和防控奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。     

非洲猪瘟病毒荧光RPA快速检测方法的建立及初步应用

本研究根据非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组中序列保守稳定的B646L基因设计特异性引物和探针,建立了敏感、特异、高效的ASFV核酸RPA快速检测法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测ASFV核酸,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪A型塞内卡病毒(SVA)等灭活病毒核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到2×101copies/uL;检测时间短,15 min即可完成反应;重复性好。采用ASFV灭活抗原和猪血液制备模拟临床猪血样品,能检出灭活抗原的稀释度为1∶12 800,应用该方法对200份进口冻猪产品及供港猪场420份猪抗凝血进行检测,结果均为阴性,与OIE推荐的实时荧光PCR法检测结果相同。本研究建立的RPA快速检测法操作简便,尤其适合ASFV现场快速检测。     

同时检测五种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR的建立

为建立一种能同时检测5种引起猪繁殖障碍的病毒的多重PCR方法,分别针对各病毒的保守序列设计了4对特异性引物,其中3对分别用于扩增猪瘟病毒(CSFV)E2基因、非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因、伪狂犬病病毒(PRV)gB基因的目的片段;针对NSP2基因设计的1对引物用于区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)。通过对反应条件的优化,建立了快速检测CSFV、ASFV、PRV、PRRSV和HP-PRRSV的多重PCR方法。敏感性试验结果显示,该多重PCR对这5种病原核酸的最低检测量分别为2.10×103(HP-PRRSV),1.30×103(PRRSV),1.09×104(CSFV),1.50×103(ASFV)和8.97×102(PRV)copies/μL。对49份临床样品的检测结果显示,它们的混合感染率为51%(25/49)。该方法对阴性样本的扩增结果均为阴性,并且无交叉反应性,表明该方法特异性良好,具有快速、灵敏且成本低等优点,能够对猪繁殖障碍病毒病的单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断,并对其流行病学调查具有深远意义。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。     

仔猪免疫PRRSV疫苗后病毒血症的荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗免疫后在猪体内病毒血症持续时间的方法。根据GenBank中PRRSV基因序列,设计1对针对N基因扩增的特异性引物,经RT-PCR扩增后连接到pMD19-T载体上,构建含有N基因片段的重组质粒。采用SYBR GreenⅠ染料法进行荧光定量RT-PCR扩增,建立标准曲线并进行特异性、敏感性及重复性试验,比较分析该方法与商品化试剂盒检测结果的阳性符合率。结果显示,所构建方法的扩增效率为1.063,标准品各稀释度质粒拷贝数与Ct值之间相关系数为0.999,引物特异性强,可检测的最低核酸模板浓度为1.0×10~2copies/L,比常规PCR敏感性高10倍,重复性试验的变异系数均小于1%,与商品化试剂盒检测的阳性符合率达100%。两种方法检测结果均表明,在猪体内PRRSV疫苗病毒血症可持续3周。本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR具有快速、特异、敏感和重复性好等优点,可为PRRSV感染(包括疫苗毒)的调查、监测和防控提供可行性和操作性强的技术支持。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用

针对靶基因库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组质粒T/PRRS-PS9、T/Y11和日本脑炎病毒(JEV)的重组质粒T/PRM/M、T/JEV-C,设计4对特异性引物,采用PCR扩增获得4个靶基因片段,并用PCR标记Cy3探针,建立了一种检测PRRSV和JEV的芯片方法。特异性试验结果显示,PRRSV、JEV之间无交叉杂交,猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒与PRRSV-JEV基因芯片无杂交反应。灵敏性试验结果显示,50μL杂交体系中探针DNA的质量浓度为0.295pg/μL时仍为杂交阳性。对从猪场收集的31份样品进行处理并用基因芯片检测,PRRSV的检出率为12.9%(4/31),JEV的检出率为9.68%(3/31),PRRSV与JEV混合感染的检出率为0(0/31)。此方法的结果与PCR的检测结果完全符合。结果表明,所建立的二联基因芯片有望成为一种快速鉴别PRRSV与JEV的新方法。     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.