化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立化脓隐秘杆菌(T.pyogenes)和溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)快速核酸检测方法,本研究根据化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA保守序列设计2对特异性引物及2条TaqMan探针。经对反应体系和反应条件进行优化,建立了化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性结果显示,该方法与金黄色葡萄球菌、停乳链球菌、肠炎沙门菌和大肠杆菌等22种常见细菌无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌质粒标准品的最低检出浓度分别为31 copies/μL和65 copies/μL,且变异系数小于3%。对45份临床肺样品的检测结果显示,化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为15.5%和24.4%。本研究建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊化脓隐秘杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的检测提供了敏感、快速的方法。     

致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌双重TaqMan荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种快速鉴别检测致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA和白细胞毒素(lktA)基因保守序列设计特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了鉴别致病性与非致病性溶血性曼氏杆菌的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法与其他24种常见牛羊细菌均无交叉反应,具有较好的特异性;其检测lktA基因阳性和阴性溶血性曼氏杆菌的最低检出限度均为40 copies,具有较好的敏感性。应用建立的双重荧光定量PCR方法和普通PCR方法对48份临床样品进行检测,这2种方法检出的溶血性曼氏杆菌阳性率分别为27.1%和18.8%,检出lktA基因阳性溶血性曼氏杆菌的阳性率分别为20.8%和12.5%,阳性符合率为100%。本研究中建立的双重荧光定量PCR方法为牛羊溶血性曼氏杆菌致病性与非致病性菌株感染的高通量快速鉴别诊断提供了可行手段。     

猪四种呼吸道病原菌四重PCR检测方法的建立与应用

为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10~3CFU/mL的Pm,1×10~2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。     

猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、准确检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌二重TaqMan荧光定量PCR方法,本研究根据猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,并优化反应条件,建立了检测猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的二重TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,所建方法特异性良好,与其他25种常见细菌均无交叉反应。猪丹毒杆菌检测在2.07×108~2.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到2.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%;溶血性曼氏杆菌检测在1.07×108~1.07×103copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到1.07×102copies/L的标准品阳性质粒,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的二重荧光定量方法和普通荧光定量方法对47份临床样品进行检测,符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及猪丹毒杆菌和溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

鉴别家兔多杀性巴氏杆菌与支气管败血波氏菌的双重TaqMan qPCR方法的建立

为提高家兔呼吸道疫病主要细菌性病原检测的可靠性和标准化,根据GenBank中多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida) Kmt基因与支气管败血波氏菌(Bordetella bronchiseptica) Fla基因分别设计特异性引物和探针,对反应条件进行优化,建立兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏菌双重TaqMan qPCR方法,并初步用于检测家兔肺脏及鼻拭子临床样本。结果显示,该方法建立的标准曲线在标准品浓度为2.35×10~6～2.35 copies/μL时有良好的线性关系;与绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、沙门菌、产气荚膜梭菌无交叉反应;最低检测限均为2.35 copies/μL;批内、批间重复性检验变异系数均小于2%。检测70份临床样本DNA结果显示,多杀性巴氏杆菌阳性率为50.0%,支气管败血波氏菌阳性率为42.9%,混合感染率为21.4%,该方法与细菌分离培养和常规PCR符合率分别为80.0%、 92.0%。以上数据表明,本研究建立的双重TaqMan qPCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,无需病原菌的培养即可用于临床样品的快速检测,为兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏菌的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、高效、准确的检测方法。     

溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、准确检测猪溶血性曼氏杆菌TaqMan荧光定量PCR方法,根据溶血性曼氏杆菌16S rRNA基因保守序列设计种特异性引物及探针,优化反应条件,建立了检测溶血性曼氏杆菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,以重组质粒pMD-MH-16S为标准品建立的标准曲线在3.06×10~8~3.06×10~1copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可以检测到3.06×101 copies/L的标准品阳性质粒。该方法与其他24种常见细菌均无交叉反应,批内和批间变异系数均小于3%。应用建立的方法和普通PCR方法对65份临床样品进行检测,阳性率分别为56.92%和21.54%,阳性符合率为100%。本研究结果表明,所建立的方法可用于牛、羊溶血性曼氏杆菌感染的高通量快速诊断以及溶血性曼氏杆菌的快速鉴定及定量分析。     

鉴别四种鸭源肠道易感病原菌的多重PCR的建立

为了建立能同时快速鉴别沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌的多重PCR检测方法,参考GenBank中沙门菌invA基因序列、鸭疫里默氏杆菌OmpA基因序列、巴氏杆菌KMT1T基因序列和大肠杆菌PhoA基因序列,分别设计特异性引物,用已分离、鉴定、保存的四种细菌DNA筛选PCR缓冲体系、扩增程序,优化退火温度与引物浓度。结果表明,设计的4对引物能分别能特异性扩增出相应的靶基因,建立的多重PCR方法特异性强、敏感性高,可用于沙门菌、鸭疫里默氏杆菌、巴氏杆菌和大肠杆菌混合感染病例的快速鉴别诊断。     

猪支气管败血波氏杆菌PCR诊断方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物fla1和fla2,扩增出大小为237 bp的目的基因片段,建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明,该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应;最低能够检出112.5 pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液;结果,检出支气管败血波氏杆菌阳性42例,阳性率为87.5%。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较;结果显示,该PCR法的检出率是细菌检查法的5.25倍,是微量凝集法的1.75倍。     

绵羊溶血性曼氏杆菌的分离鉴定

本研究对疑似患有溶血性曼氏杆菌的病羊肺组织进行病原分离,并对分离菌株进行生化反应、动物致病性试验、PCR鉴定和药敏试验。结果表示,分离菌株为革兰阴性短杆菌且具有较强的致病性,经生化试验和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌,该分离菌株对大部分抗菌药物敏感,对红霉素和庆大霉素、磺胺间甲氧嘧啶耐药。本研究为溶血性曼氏杆菌病选择合理、正确的抗菌药物提供了一定的科学依据,并为进一步研究其耐药机制奠定了基础。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及毒力基因检测

为确定黑龙江省2个规模化奶牛场犊牛急性呼吸道感染的病因,笔者进行了病原的分离纯化,细菌16S rDNA基因和多杀性巴氏杆菌特异性基因OmpH鉴定、生化试验、药敏试验、半数致死量试验、荚膜血清型分型及22种毒力因子的检测,以确定主要病原的种类、型别及生物学特性。结果表明,从死亡牛肺和患病牛鼻拭子分离的2株病原菌均为荚膜A型多杀性巴氏杆菌,分别被命名为WC16551和LY01,序列分析结果表明,其与牛源多杀性巴氏杆菌同源性达到99%以上。药敏试验显示2株菌均对恩诺沙星、环丙沙星高度敏感。半数致死量结果表明,LY01菌株的毒力明显强于WC16551菌株,2株分离菌均携带19种毒力因子,未检出hgbB、toxA和nanB三种基因。上述研究结果表明,导致2个牛场发病的主要病原菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌。     

兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因的克隆与原核表达

为克隆和表达兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2基因,并对其表达产物的反应原性进行研究,用设计的1对特异性引物对兔多杀性巴氏杆菌CVCC500株总DNA进行ompH2基因的PCR扩增。将PCR片段克隆至pMD18-T载体中,进行测序。随后,将该基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,将重组表达质粒pET30a(+)-ompH2转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导。测序分析证明,得到了1条大小为1 052bp的基因片段,与国内外报道的兔多杀性巴氏杆菌ompH2基因的核苷酸序列相似性达99%以上。重组表达质粒的酶切鉴定、PCR扩增和测序分析表明,重组表达载体构建成功。SDS-PAGE检测结果证实,该基因可以在大肠杆菌中表达,表达产物为分子质量约47ku的融合蛋白。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白ompH2具有反应原性。为研究兔多杀性巴氏杆菌外膜蛋白ompH2的免疫学活性奠定了基础。     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及其应用

设计了 1对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养 ,然后挑菌做PCR ,同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果 ,从不同省 (市 )的送检病料中分离鉴定出 6 6株多杀性巴氏杆菌 ,PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合 ;该引物对其他 6种猪的常见呼吸道病原菌的扩增结果均为阴性 ;该PCR检测方法能检出CFU为 10 3/mL的巴氏杆菌模板。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2014年3月至2015年2月从来源于全国15个省份的180份临床猪肺组织样品中共分离到71株多杀性巴氏杆菌,分离率为39.4%。利用PCR技术对所分离的多杀性巴氏杆菌进行荚膜血清型鉴定,其中A型菌株41株(占57.8%),D型菌株27株(占38.0%),F型菌株3株(占4.2%),71株多杀性巴氏杆菌中包括1株D型产毒素多杀性巴氏杆菌(占1.4%),说明当前在我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌主要为A型和D型菌株。应用PCR检测多杀性巴氏杆菌23种毒力基因,结果显示:多杀性巴氏杆菌毒力基因的数量大多分布在15~19之间,平均携带个数为17.5个;23种毒力基因中,ptfA,fimA,hsf-2,sodA,sodC,ompA,ompH,oma87,plpB,exbB,tonB,Fur,hgbB的检出率在90%以上,而toxA基因的检出率极低(1.4%),并且在猪源多杀性巴氏杆菌中未检测到t bpA的存在;分析毒力基因在不同血清型菌株中的携带及分布情况发现,A型的平均毒力基因携带数为18.2个,D型为16.4个;不同毒力基因在不同血清型的多杀性巴氏杆菌中的分布也存在一定的差异,其中唾液酸代谢酶基因nanB、透明质酸酶基因pmHAS及黏附基因tadD和pfhA在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率高于其在D型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01);而黏附基因hsf-1在D型多杀性巴氏杆菌的检出率显著高于其在A型多杀性巴氏杆菌中的检出率(P0.01)。对所分离菌株的16SrRNA基因进行测序,并与NCBI上公布的10株多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因进行进化树分析,结果显示:71株多杀性巴氏杆菌主要分为2个亚群,亚群Ⅰ和HB03及3480的亲缘关系较近,而亚群Ⅱ则与HN06、Pm70、36950等菌株的亲缘关系较近;遗传进化的结果说明,多杀性巴氏杆菌的亲缘关系与其来源、血清型及其导致的疾病种类并没有表现出特定的亲缘关系。     

副猪嗜血杆菌与猪链球菌2型双重LAMP检测方法的建立

根据副猪嗜血杆菌的inf B基因和猪链球菌2型的Cps2j基因各设计1套LAMP引物,在同一体系中进行双重LAMP扩增,采用琼脂糖凝胶电泳和SYBR GreenⅠ荧光检测,并对双重LAMP扩增产物进行熔解曲线的分析,建立了副猪嗜血杆菌与猪链球菌2型双重LAMP检测方法并进行了特异性和灵敏度试验。结果显示,该方法的灵敏度比常规PCR高两个数量级。通过熔解曲线特征峰的分析可以判断感染的确切目标菌株,且与其他的病原菌无交叉反应。对29份临床样品检测的结果显示,普通PCR和双重LAMP的检出率分别为17.0%和31.0%。结果表明,该方法具有良好的灵敏度和特异性,可实现两种病原的同步快速检测,对于临床疫病的初筛有一定的帮助。     

丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法的建立

为建立高效快速的丹毒丝菌属荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据丹毒丝菌属16S r RNA基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准品浓度在1.06×106~1.06×101copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到1.06×10-2 copies/L的标准品阳性质粒;该方法与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等22种细菌和病毒无交叉反应;批内和批间的变异系数(CV)均小于3%。对临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

猪源荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为确定导致猪细菌性感染死亡的病原,从送检病死猪肺中分离纯化出1株细菌,通过对该菌株进行培养特性观察、生化反应、药敏试验、动物致病性试验,并采用PCR对该分离菌株进行了种属及荚膜血清型鉴定。结果显示,该分离菌株革兰染色为阴性。生化试验及PCR鉴定结果显示,该分离菌株为荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌,其对小鼠有强致病性。此次分离的这株多杀性巴氏杆菌形态结构和生化特性比较典型,毒力较强,且为较少见的荚膜血清F型多杀性巴氏杆菌。这一结果为进一步研究多杀性巴氏杆菌的致病机理奠定了基础。     

多重PCR在多杀性巴氏杆菌荚膜定群中的应用

为了修订行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》(NY/T 564-2002),改进多杀性巴氏杆菌荚膜定群方法,制备了多杀性巴氏杆菌分群抗血清,并建立了多重PCR,对53株菌同时用血凝方法及多重PCR进行定群。经正向间接血凝试验测定,制备的各型血清仅与对应型抗原发生凝集反应,表明血清具有较高的特异性,可作为多杀性巴氏杆菌的荚膜定群抗血清。53株多杀性巴氏杆菌均扩增出了相应的预期片段,PCR结果与Carter氏间接血细胞凝集试验结果相一致。结果表明,可将多重PCR增添至行业标准中,用其代替原有血清学方法进行多杀性巴氏杆菌荚膜定群。     

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

牛支原体肺炎PCR诊断方法的建立及初步应用

参照GenBank中牛支原体脂蛋白P48基因序列,设计并合成特异性引物Mb-F/Mb-R,建立了牛支原体PCR检测方法,并在扩增条件优化的基础上,对该方法的特异性和灵敏度进行了分析,进而应用建立的方法完成了疑似牛支原体肺炎临床病料的检测。结果显示,建立的PCR方法对牛支原体的核酸样品能扩增出534 bp的特异性目的片段,而对无乳支原体、丝状支原体、大肠杆菌、绿脓杆菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、肺炎克雷伯氏菌、黏质沙雷氏菌、变形杆菌等牛常见条件病原微生物核酸样品均未见明显的扩增条带,且其可检测出的牛支原体DNA最低浓度约为0.000 002 875μg/mL。对临床样品的检测结果显示,该方法的检出率与与病原分离的符合率为100%。上述结果表明,本研究成功建立了牛支原体PCR检测方法,可用于临床上牛支原体肺炎的快速诊断。     

鸡毒支原体鸡滑液囊支原体和副鸡禽杆菌三重PCR检测方法的建立

鸡毒支原体(MG)、鸡滑液囊支原体(MS)、副鸡禽杆菌(APG)三重PCR诊断对于鸡呼吸道疾病的鉴别诊断和防控有着重要意义。本次试验首先对三重PCR反应条件进行优化,之后对多种病原的DNA进行扩增以确定本方法的特异性,调整MG、MS和APG的DNA浓度以确定本方法的敏感性。结果显示,利用优化后的反应条件,本试验建立的诊断方法能够同时扩增出长度为453 bp(MG)、328 bp(MS)和241 bp(APG)的特异性片段,而大肠杆菌、鸡白痢沙门菌、禽多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和阴性对照样品在检测时则无条带产生。对三种病原的混合DNA进行10倍梯度稀释,确定MG、MS和APG的最低检出量为5×10^-3ng/μL。对37份临床样品的检测结果表明,三重PCR的检出率和单重PCR的检测结果一致,且可同时检测出两种或三种病原同时感染。上述结果表明,本试验建立的MG、MS和APG三重PCR诊断方法具有良好的特异性、较高的灵敏性,可用于鸡呼吸道病的诊断和防控。