环形泰勒虫微线体-棒状体基因的原核表达及表达产物的免疫原性分析

为了解环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的生物学特性,通过生物信息学分析,选取环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白特异性和抗原性最高的一段开放阅读框进行RT-PCR扩增,将所获基因片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1中进行表达,将表达产物纯化后免疫家兔制备该蛋白的多克隆抗体。通过SDS-PAGE和Western-blot分析该基因的原核表达情况和表达产物的反应原性。生物信息学分析发现,该蛋白第470~650位氨基酸残基的特异性和抗原性最高。对诱导条件的摸索发现,在37℃、1.0mmol/L IPTG条件下诱导6h表达量最高,表达产物大小为43ku。Western-blot结果显示,该蛋白能被环形泰勒虫阳性的牛血清所识别,具有很好的反应原性。本研究制备的多克隆抗体为后期研究微线体-棒状体蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

环形泰勒虫微线体-棒状体蛋白的亚细胞定位分析

为研究微线体-棒状体蛋白在环形泰勒虫裂殖体及其在感染环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞中表达情况及亚细胞定位,应用Western-blot验证了该蛋白多克隆抗体的特异性;通过条件摸索找出最佳比例的固定剂和最佳一抗、二抗的工作浓度;利用优化好的条件对微线体-棒状体蛋白进行间接免疫荧光试验,用激光共聚焦技术确定该蛋白在环形泰勒虫裂殖体和其在感染的淋巴细胞中表达及亚细胞定位。结果表明,微线体-棒状体蛋白主要定位于环形泰勒虫裂殖体的表面,而在宿主淋巴细胞细胞质中分布较少。     

绵羊CD46基因的克隆及真核表达

为了研究绵羊CD46蛋白的功能,根据从GenBank数据库获得的绵羊CD46基因的部分cDNA序列设计引物,以绵羊外周血淋巴细胞总RNA为模板,应用RACE方法扩增了绵羊CD46基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对CD46cDNA及CD46蛋白结构进行了预测分析。结果显示,绵羊CD46cDNA序列开放阅读框长1 083bp,编码由360个氨基酸残基组成的多肽,该多肽的理论分子质量为39ku,理论等电点为6.5。对该蛋白结构分析时发现,绵羊CD46第1~42位氨基酸残基为信号肽序列,共有5处N糖基化位点,4处蛋白激酶C磷酸化位点,5处Ⅱ-酪蛋白激酶磷酸化位点,7处N-豆蔻酰化位点。二级结构中无α螺旋,β折叠占26.1%,其余73.9%为转角,该蛋白具有4个结构域,与人源CD46的同源性较高。同时将CD46基因克隆到pCMV-Myc载体中,构建了真核表达质粒pCMV-Myc-CD46;将构建的重组质粒转染哺乳动物细胞CHO-K1以进行瞬时表达。Western-blot结果显示,CD46基因在真核细胞中成功获得了表达。上述研究结果为以后开展绵羊CD46的功能研究奠定了基础。     

中华泰勒虫MPSP基因的原核表达及反应原性分析

用生物信息学方法,对中华泰勒虫的梨浆虫主要表面蛋白(major piroplasm surface proteins,MPSP)基因的核苷酸序列及编码蛋白的氨基酸序列进行了分析,并对该蛋白的抗原表位、信号肽以及跨膜区进行了预测。设计特异性引物,对中华泰勒虫MPSP基因进行了克隆和原核表达,并对融合蛋白的反应原性进行了分析。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白的分子质量约为38ku,分布于上清中。Western-blot试验表明,融合蛋白仅与抗His标签蛋白的单克隆抗体、中华泰勒虫阳性血清、瑟氏泰勒虫阳性血清、环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与其他泰勒虫、巴贝斯虫和绵羊无形体阳性血清不发生反应。这些结果表明,中华泰勒虫MPSP可作为ELISA诊断方法的候选抗原。     

狂犬病病毒aG株G基因的克隆与生物信息学分析

为了研究狂犬病病毒aG株的进化情况,分析狂犬病病毒的遗传变异和基因功能,采用BHK-21细胞培养繁殖狂犬病病毒aG株,运用RT-PCR扩增G基因,将其与pMD18-T simple vector连接后转化JM109感受态细胞,经PCR扩增和测序分析进行鉴定,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示,狂犬病病毒G蛋白基因全长1 575bp,包含1个阅读框(ORF),编码524个氨基酸。生物信息学分析表明,G蛋白的分子质量为58 377.22u,理论等电点为7.080,半衰期为30h(体外哺乳类网状细胞),不稳定系数为42.99,脂肪指数为88.45,总平均亲水性为-0.106,最大疏水性为3.489,最小疏水性为-2.600,信号肽序列为1～19位氨基酸残基,跨膜区结构分析显示该蛋白为跨膜蛋白,预测可能包含有4个N-糖基化作用位点,2处基于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,13处蛋白激酶C磷酸化位点,12处酪蛋白Ⅱ磷酸化位点;1处酪氨酸激酶磷酸化位点;9处N豆蒄酰化位点;1个酰胺化位点。系统进化分析表明,aG株G蛋白与DRV株进化距离最近。     

吕氏泰勒虫TlSP无跨膜区重组蛋白的表达及反应原性分析

提取吕氏泰勒虫裂殖子的总RNA,采用RT-PCR方法扩增其表面蛋白TlSP(Theileria luwenshuni surface protein)基因的cDNA片段,结合生物信息学方法,对TlSP蛋白抗原表位和跨膜区进行预测,设计表达引物,分别扩增得到TlSP全长及逐一去除跨膜区的4个片段,并将其分别克隆至pET-30a原核表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达,并对融合蛋白的反应原性进行分析。结果表明,TlSP融合蛋白的N端具有较好的抗原性,而在C端存在3个跨膜区:185~207 aa、228~250 aa和255~277 aa;SDS-PAGE结果表明,只有去除全部跨膜区的重组载体可成功表达。Western-blot分析表明,TlSP融合蛋白能与吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫、绵羊泰勒虫及环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与巴贝斯虫、羊无浆体阳性血清无交叉反应。本研究为今后TlSP候选亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

环形泰勒虫TaSDP基因的原核表达及TaSDP蛋白多克隆抗体的制备

利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增TaSDP(Theileria annulata schizont-derived protein)基因,用获得的基因片段构建原核表达载体pET-30a(+)-TaSDP,并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行表达,蛋白以包涵体的形式存在;融合蛋白经纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,并分别用ELISA和Western-blot测定抗体的效价及特异性。结果显示,获得的TaSDP基因的长度为552bp,制备的多克隆抗体不仅可与重组蛋白His-TaSDP发生反应,而且可以识别天然的虫体蛋白,效价高于1∶215。上述研究结果为开展TaSDP在细胞调控方面的研究奠定了基础。     

环形泰勒虫SPAG蛋白的原核表达及反应原性分析

根据GenBank中公布的环形泰勒虫子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,结合生物信息学分析,对SPAG蛋白跨膜区和抗原表位进行分析。选取基因片段设计表达引物,从环形泰勒虫不同虫株的SPAG基因的保守区扩增目的片段,并构建SPAG-pET-30a重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中进行表达,并对SPAG重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,获得的SPAG基因片段长度为882 bp,重组蛋白分子质量约为42 ku。反应原性分析显示,该重组蛋白可与环形泰勒虫阳性血清发生特异性反应,与中华泰勒虫、瑟氏泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应。本研究结果表明,SPAG蛋白有较好的反应原性和种特异性,可作为检测环形泰勒虫的候选抗原建立相应血清学诊断方法。     

旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因TsCystatin1的克隆及序列分析

为了研究旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的功能,应用电子克隆的方法从GenBank EST数据库获得1个旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(TsCystatin1)的部分cDNA序列,据此设计引物,并以旋毛虫新生幼虫总RNA为模板,进行反转录及PCR,克隆到该基因的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对其进行了预测分析。结果表明,TsCystatin1 cDNA序列含有一个由666个核苷酸组成的开放阅读框架,编码由221个氨基酸残基组成的多肽,蛋白分子质量理论值为24.3ku,理论等电点为4.44。TsCystatin1第1～25位氨基酸残基为信号肽序列,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的保守序列QVVAG,其C末端具有3处N-糖基化位点以及4个链内二硫键所需的半胱氨酸残基。该蛋白的二级结构中α螺旋占18.6%,β折叠占23.5%,其余57.9%为转角。结构域分析表明,该蛋白具有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂样结构域,属于半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族2,与其他线虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的同源性较高。     

感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞酵母双杂交文库的构建

为研究环形泰勒虫裂殖体与牛淋巴细胞之间的相互作用,以感染了环形泰勒虫裂殖体的淋巴细胞系为材料,构建了感染环形泰勒虫裂殖体的牛淋巴细胞系的酵母双杂交cDNA文库。首先,提取纯化细胞系的mRNA,经反转录合成第一条链cDNA,通过LD-PCR合成双链cDNA。柱层析剔除250bp以下的小片段;将双链cDNA与经SmaⅠ处理过的文库质粒pGADT7-Rec一起转入到酵母Y187感受态细胞内,双链cDNA与文库质粒会发生同源重组,经过抗性筛选即可得到酵母双杂交cDNA文库。文库构建结果显示,该文库库容量达2.4×107 CFU,插入片段的平均长度在1 000bp左右,达到试剂盒建库要求。     

猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因的克隆与序列分析

为了研究猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的结构特征及编码蛋白的功能,根据GeneDB中获得的2条cDNA序列设计引物,以猪囊尾蚴总RNA为模板进行RT-PCR,获得猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(TsoStefin和TsoCystatin)基因的完整开放阅读框序列,并进行生物信息学分析。结果表明,所获得的2条序列均含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂特征性的结构域。TsoStefin由98个氨基酸残基组成,不含二硫键和糖基化位点,为细胞内蛋白;TsoCystatin由274个氨基酸残基构成,含有1个糖基化位点和2个相似的结构域,第1~18位氨基酸残基组成信号肽,属分泌型蛋白。系统发育树显示,TsoStefin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族1的成员,TsoCystatin属家族2的成员,与部分绦虫的亲缘关系较近。从上述结果推测,所获得的2条基因均属于猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因。     

边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法的建立

将边缘无浆体MSP5基因在大肠杆菌DH5α中表达,获得45 ku的融合蛋白.Western-blot检测证实该表达蛋白具有良好的生物学活性.以纯化的融合蛋白为抗原,建立了边缘无浆体MSP5的间接ELISA检测方法.该方法对边缘无浆体阴性、阳性血清(各100份)的阳性检出率和阴性符合率分别为100%和98%,与双芽巴贝虫、大巴贝虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、衣原体、血吸虫和羊肝片吸虫的阳性血清无交叉反应,与羊无浆体阳性血清有交叉反应.结果表明,建立的间接EHSA方法具有良好的特异性和敏感性.     

旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达

用旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库中的T54克隆作为核酸探针,对旋毛虫成虫和新生幼虫混合cDNA文库进行筛选,获得1个全长1464 bp的cDNA分子.该cDNA含有1个1290 bp的开放阅读框架(ORF),Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA.该ORF编码1个429个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量理论推导值为49.9 ku,等电点为5.6,在12-14及103-105氨基酸残基处分别有2个糖基化位点NLS及NVS,在C末端344-409氨基酸残基处有1个FYVE锌指结构域(Profile PS50178).Blastp同源性分析表明,与广东管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)66.0 ku蛋白(gi/1743430)同源性最高,为39.0%.在此基础上对旋毛虫FYVE锌指结构重组蛋白进行了表达,表达蛋白占茵体蛋白的24%.     

马泰勒虫EMA1基因的克隆与生物学特性分析

根据GenBank上登录的马泰勒虫美国株(AB043618)裂殖子表面蛋白抗原1(EMA1)基因,设计了2对引物,采用PCR技术首次扩增出我国马泰勒虫肇源株EMA1基因。将该基因克隆到pMD19-T载体后,进行序列测定及分析。将鉴定为阳性的克隆重组到原核表达载体pET-30a后进行表达,并纯化表达的重组蛋白,进行Western-blotting试验,以鉴定其生物学活性。结果,EMA1基因长819bp,编码272个氨基酸,将该基因编码蛋白的氨基酸序列与GenBank中登录的11种已知梨形虫的相应氨基酸序列进行比较分析,马泰勒虫肇源分离株与已报道的马泰勒虫(马巴贝斯虫)亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫和斑羚泰勒虫,而与东方泰勒虫、瑟氏泰勒虫的亲缘关系较远。表达的重组蛋白是分子质量约为38ku的融合蛋白,且表达产物能被马泰勒虫标准阳性血清识别。结果表明,马泰勒虫EMA1作为一种良好的抗原分子,在虫株的分类学研究、流行病学调查以及候选疫苗的研制中有着重要的意义。     

我国羊巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因的克隆与结构和遗传进化分析

用牛巴贝斯虫棒状体颈部蛋白RON2基因序列BLAST我国羊感染的2种巴贝斯虫全基因组数据库,以获得的RON2基因保守序列片段为模板设计PCR引物;从6株羊巴贝斯虫基因组DNA和c DNA中扩增RON2基因全长序列,分析其基因结构特征;并通过序列比对和进化树构建,分析我国羊巴贝斯虫的遗传进化关系。结果显示,该基因无内含子,羊巴贝斯虫未定种新疆株/敦煌株(BspX J/DH)、莫氏巴贝斯虫天祝株/临潭株(BmTZ/LT)和莫氏巴贝斯虫宁县株/河北株(BmNX/HB)RON2蛋白基因ORF的大小分别为4 029、4 047和4 044 bp,编码1 345、1 349和1 348个氨基酸。RON2蛋白的分子质量约为151 ku,等电点为8.91,具有3个跨膜区,N端第1～29位氨基酸为其信号肽区域。RON2核苷酸和氨基酸序列比对分析结果显示,BspXJ/DH与BmTZ/LT和BmNX/HB的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为67.0%～67.4%和69.2%～69.3%,BmTZ/LT和BmNX/HB间的相似性分别为92.8%～92.9%和91.1%～91.2%。系统发生树上羊巴贝斯虫未定种和莫氏巴贝斯虫分别位于2大支,莫氏巴贝斯虫又被分为2小支。该结果为开展我国羊巴贝斯虫的分类关系和RON2基因功能的研究提供了基础数据。     

旋毛虫半胱氨酸蛋白酶基因TsCP1的克隆与序列分析

为了研究旋毛虫半胱氨酸蛋白酶的功能,根据GenBank中旋毛虫EST数据库的半胱氨酸蛋白酶基因部分cDNA序列设计引物,以旋毛虫肌幼虫总RNA为模板,进行RT-PCR,克隆到旋毛虫半胱氨酸蛋白酶基因(TsCP1)的完整开放阅读框序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析。结果表明,TsCP1cD-NA序列含有一个由1 101个核苷酸组成的开放阅读框,编码由366个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质的分子质量理论值为41.9ku,理论等电点为7.46。TsCP1二级结构中α螺旋占31.4%,β折叠占15.3%。TsCP1第1～19位氨基酸残基为信号肽序列,具有3处N-糖基化位点,而且具有半胱氨酸蛋白酶的保守活性位点Cys173,His309及Asn333残基,另外在酶前体序列中有与组织蛋白酶F特征基序ERFNAQ相似的LKFNAQ序列,表明该蛋白属于半胱氨酸蛋白酶家族的组织蛋白酶F亚类。同源性分析表明与其他寄生性蠕虫组织蛋白酶F的一致性在40%以上,系统进化分析表明与吸虫的组织蛋白酶F属于不同的进化分支。     

莫氏巴贝斯虫trap基因的克隆表达及反应原性分析

本研究以莫氏巴贝斯虫临潭株为研究对象,分别从其基因组D N A和c DNA中成功扩增trap基因全长,应用生物信息学分析软件分析验证了该基因和蛋白的结构;构建p ET-30a-trap原核表达载体,转入大肠杆菌BL21(DE3)p Lys S感受态细胞进行诱导表达;表达产物超声破碎后,对上清和沉淀进行SDS-PAG E分析。纯化可溶性的r Bm TRAP,W estern-blot分析其反应原性。结果显示,莫氏巴贝斯虫trap基因具有4个内含子和5个外显子,开放阅读框大小为2 100 bp。第1~23位氨基酸为信号肽序列,第45~201和第238~302位分别为TRAP蛋白家族的v WA和TSP1结构域;重组蛋白r Bm TRAP以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株阳性血清可特异性识别r Bm TRAP,而与莫氏巴贝斯虫宁县株和河北株、羊巴贝斯虫未定种新疆株和敦煌株、吕氏泰勒虫和羊无浆体阳性血清无交叉反应。结果表明,r Bm TRAP具有作为血清学诊断方法候选抗原的潜力,为将来建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫临潭株、天祝株感染的免疫学诊断方法奠定了基础。     

多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1基因的克隆及原核表达

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用Western-blot分析该蛋白的抗原性。结果显示,TmAdh1的基因组序列长1 848bp,由2个内含子和3个外显子组成,其开放阅读框的长度为402bp,编码133个氨基酸残基。预测分析表明,TmAdh1蛋白含有1个N端信号肽序列、1个纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域、1个糖基化位点和8个线性B细胞抗原表位。在原核系统成功表达了约40ku的重组蛋白TmAdh1,用其免疫小鼠制备超免疫血清。Western-blot试验表明,重组蛋白TmAdh1可以与免疫小鼠血清反应。以上研究结果表明,多头带绦虫TmAdh1基因是带科绦虫宿主保护性抗原的同源基因,可作为脑多头蚴病疫苗的候选分子。     

尤氏泰勒虫OPRT基因的优化表达

为克隆和表达尤氏泰勒虫OPRT基因的功能区片段,并对重组OPRT蛋白的反应原性进行分析,以反转录得到的尤氏泰勒虫cDNA链为模板,PCR扩增出OPRT基因片段,然后将其克隆至pET-30a(+)载体;把构建成功的重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21进行优化表达,对诱导表达的蛋白纯化后用Western-blot分析它与吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫阳性血清是否发生交叉反应。结果显示,OPRT基因获得了不可溶性表达,最佳表达时间为6h,最佳表达温度为28℃,且表达的重组OPRT蛋白分别与上述2种泰勒虫阳性血清发生交叉反应。结果表明,OPRT同源基因也存在于吕氏泰勒虫和绵羊泰勒虫之中。     

双芽巴贝斯虫RAP-1C基因的克隆表达及重组蛋白反应原性的研究

拟通过对双芽巴贝斯虫棒状体相关蛋白1(rhoptry-associated protein-1,RAP-1)羧基端进行研究,以期了解该蛋白的一些免疫学特性。利用生物信息学软件,对RAP-1进行抗原表位预测,并与其他重要的巴贝斯虫和泰勒虫相应基因序列进行比对,以筛选出抗原性和特异性均良好的基因片段;针对筛选出的基因片段设计引物,对该基因进行克隆和原核表达,最后利用Western-blot对重组蛋白的反应原性和特异性进行分析。结果显示,融合目的蛋白含His标签,分子质量为26ku左右,该蛋白只与双芽巴贝斯虫阳性血清发生特异性反应,与其他主要巴贝斯虫、泰勒虫的阳性血清无交叉反应。结果表明,表达的PAP-1蛋白可作为ELISA诊断方法的候选抗原,为建立一种双芽巴贝斯虫病特异性的免疫学诊断方法奠定了基础。