旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerpin)基因的克隆及序列分析

为了分析旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂(TsSerpin)的分子特征,提取了旋毛虫标准株ISS534,河南、云南、天津、西安、哈尔滨等6个猪旋毛虫分离株基因组DNA,设计引物进行PCR扩增,克隆不同虫株TsSerpin基因组的DNA序列。将PCR产物连接到pMD18-T载体后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行序列测定,利用生物信息学软件对TsSerpin基因序列进行预测分析。结果显示,TsSerpin cDNA序列含有1个由1 122个核苷酸组成的开放阅读框,编码由373个氨基酸残基组成的多肽,蛋白质分子质量的理论值为42.5ku,理论等电点为6.54。该蛋白的二级结构中,α螺旋占36.7%,β折叠占25.2%,其余38.1%为无规则卷曲。TsSerpin第14~373位氨基酸序列为Serpin结构域,具有Serpin的保守序列FVADHPFLFFI。线性B淋巴细胞抗原表位分析显示,TsSerpin中含有12个潜在的B细胞抗原表位。TsSerpin基因的开放阅读框对应的基因组序列包含3个外显子和2个内含子。不同旋毛虫分离株TsSerpin序列高度保守,一致性在99%以上。上述研究结果为进一步研究TsSerpin蛋白的生物学功能和研制新型抗旋毛虫疫苗奠定了基础。     

我国耳萝卜螺ITS及5.8S rDNA的克隆及序列分析

以采自我国黑龙江省大庆市的耳萝卜螺样品为研究对象,利用核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区序列(ITS)的遗传标记特点,用保守引物BD1和BD2对rDNA内转录间隔区(ITS)及5.8S序列进行PCR扩增,扩增纯化后克隆至pMD18-T载体,重组质粒通过菌液PCR鉴定后,对阳性菌落进行测序和分析。结果显示,所获得的23个耳萝卜螺样品的ITS及5.8SrDNA序列总长度为1 124～1 130bp,存在一定差异,包含ITS-1(548～551bp)、5.8S(175bp)、ITS-2(399～404bp)序列。23个黑龙江省耳萝卜螺之间ITS-1序列的相似性在98.3%以上,ITS-2序列相似性在98.2%以上;而与GenBank中其他椎实螺的ITS-1序列的相似度低于75.6%,与ITS-2序列的相似度低于83.1%。由于耳萝卜螺ITS序列种内相对保守,种间差异较大,故可作为椎实螺种间遗传变异研究的标记。本研究结果为耳萝卜螺的分类鉴定以及进一步的分子流行病学研究奠定了基础。     

多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1基因的克隆及原核表达

为研究多头带绦虫黏着蛋白TmAdh1的功能,利用PCR分别以多头带绦虫基因组DNA和cDNA为模板扩增TmAdh1的基因组序列和cDNA序列,并利用生物信息学软件对该基因进行预测分析。将TmAdh1基因片段连接至原核表达载体pGEX4T-1进行原核表达,并利用Western-blot分析该蛋白的抗原性。结果显示,TmAdh1的基因组序列长1 848bp,由2个内含子和3个外显子组成,其开放阅读框的长度为402bp,编码133个氨基酸残基。预测分析表明,TmAdh1蛋白含有1个N端信号肽序列、1个纤连蛋白三型(FnⅢ)结构域、1个糖基化位点和8个线性B细胞抗原表位。在原核系统成功表达了约40ku的重组蛋白TmAdh1,用其免疫小鼠制备超免疫血清。Western-blot试验表明,重组蛋白TmAdh1可以与免疫小鼠血清反应。以上研究结果表明,多头带绦虫TmAdh1基因是带科绦虫宿主保护性抗原的同源基因,可作为脑多头蚴病疫苗的候选分子。     

弓形虫RH株热应激蛋白40基因的克隆与原核表达

为研究弓形虫热应激蛋白40(TgHSP40)的生物学特性,采用RT-PCR方法从弓形虫RH株中扩增出TgHSP40基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET-30a(+)后转化入表达菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,应用Western-blot对重组蛋白的反应原性进行分析。结果显示,重组菌可表达出分子质量约46ku的重组融合蛋白,在37℃、IPTG浓度为1.0mmol/L、诱导6h的情况下表达效果最好。重组蛋白经纯化后进行的Western-blot分析证实,表达、纯化的弓形虫RH株HSP40蛋白具有良好的反应原性,与弓形虫基因Ⅰ型的RH株、基因Ⅱ型的PRU株以及基因型为ToxoDB9的TgC7株和GJS株的阳性血清均可发生特异性反应,预期可作为弓形虫病ELISA诊断方法的候选抗原。本研究结果为弓形虫病新型诊断方法的建立奠定了基础。     

大片吸虫Ras家族蛋白基因的克隆表达及免疫反应性研究

Ras家族相关蛋白是多种信号转导途径的关键组成蛋白,在寄生虫的生长发育过程中发挥着重要作用,但大片吸虫的Ras家族蛋白基因(Fg Rap1)尚未见报道。本研究旨在对Fg Rap1进行克隆、表达、序列分析及免疫反应性评价。根据肝片吸虫的基因组及转录组数据,设计肝片吸虫Ras家族蛋白基因引物,以大片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR获得Fg Rap1基因;对其进行生物信息学分析及鉴定;然后构建p ET-SUMO-Fg Rap1重组表达载体,在大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,大片吸虫Fg Rap1基因大小为648 bp,编码215个氨基酸残基。生物信息学分析表明,该蛋白含有9个亲水区,但无跨膜区,有6个α螺旋、8个β折叠、2个较长的β转角、1个较长的无规则卷曲和8个主要的线性B细胞抗原表位。Fg Rap1蛋白为包涵体表达,用大片吸虫排泄分泌抗原免疫家兔的阳性血清进行Western-blot分析,表明其具有良好的免疫反应性。本研究首次克隆并鉴定了大片吸虫Ras家族蛋白基因,表达的重组蛋白具有良好的免疫反应性,该蛋白是潜在的大片吸虫诊断候选抗原。     

弓形虫RH株ROP38基因的原核表达及其反应原性研究

为了研究弓形虫ROP38(TgROP38)蛋白的性质和反应原性,以弓形虫RH株基因组DNA为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增TgROP38基因。测序后,将核苷酸序列翻译成氨基酸序列并利用生物信息学软件进行分析。将测序正确的片段连接至pET-30a(+)表达载体后,进行原核表达,并用Western-blot检测其反应原性。结果表明,成功扩增出大小约为1 600bp的TgROP38基因。将其翻译成氨基酸序列后,经生物信息学软件分析得出TgROP38蛋白是跨膜蛋白,含有多个亲水区域和B细胞表位。SDS-PAGE分析和Western-blot分析表明,TgROP38蛋白的大小约为66ku,且具有较好的反应原性。结果表明,TgROP38蛋白可作为抗弓形虫病疫苗候选分子研制弓形虫病亚单位疫苗及表位疫苗。