PRRSV兰州分离株ORF3和ORF5基因的克隆与序列分析及其杆状病毒表达载体的构建

根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)中国代表株CH-1a的基因组序列,设计包含完整ORF3、ORF5基因序列的2对特异引物,利用RT-PCR技术扩增PRRSV兰州分离株(Lanzhou株)的ORF3和ORF5基因,并对其进行序列测定,同时与已发表的13株PRRSV进行同源性比较.将扩增的PRRSV Lanzhou株ORF3、ORF5基因分别克隆到杆状病毒表达载体pFastBacHTA上,将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒pFastBacHTA-ORF3、pFastBaeHTA-ORF5分别转化到DH10Bac感受态细胞.结果显示,ORF3、ORF5基因长度分别为765 bp、603 bp,发现核苷酸的同源性分别为88.0%～99.2%、87.3%～99.0%,获得了重组转座子rBacmid-ORF3、rBacmid-ORF5.     

高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析

从广东省不同地区疑似高致病性猪生殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒,经RT-PCR检测,确定分离物中存在美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将此细胞病毒液命名为GDB1,用其感染回归5头40日龄健康仔猪,采集发病及死亡猪组织,重新用Marc-145细胞进行病毒分离,将再次分离到的病毒命名为GDB1F.对GDB1、GDB1F的Nsp2、ORF5基因序列进行测定分析.结果表明,单独感染猪2/2发病死亡,同居感染的3头猪全部发病,2头死亡;感染后2～4 d所有感染猪均出现体温升高.死亡猪表现为严重的出血性、间质性肺炎,肢体远端皮表出血.序列分析结果表明,GDB1和GDB1F株的Nsp2基因与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HN2 Nsp2、HNXT1、HNyz、HUB2、HUN1的同源性很高,达98.4%～99.0%.GDB1和GDB1F株的ORF5基因存在部分突变,没有缺失,与国内高病性PRRSV分离株JXA1、HUB2、JX0612、GDZC1的同源性高达97.5%～99.8%.     

猪生殖与呼吸综合征病毒NX/ZhW/07株的分离鉴定及其ORF5、Nsp2基因特性分析

将2007年宁夏送检的疑似猪高热病病料处理后接种于Marc-145细胞,结果Marc-145细胞出现典型的细胞病变,应用猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病原检测试剂盒从细胞培养物中检测到PRRSV,将其命名为NX/Zhw/07.采用RT-PCR方法扩增该分离株的ORF5和Nsp2基因,并进行序列分析.结果表明,NX/ZhW/07株的ORF5基因与GXHP-5、Hainan-1、HUBl、Hunan-1、JIANGSU、Jiangxi-1、LN-5和SHH-5株的核苷酸序列的同源性分别为92%～94%,其中与CH-la株的核苷酸序列的同源性最高,达99.2%.Nsp2基因序列分析显示,出现30个氨基酸的不连续缺失,与国内高热病分离株JXA1的缺失位置完全一致.由此推测NX/ZhW/07株属于PRRSV美洲型变异株.     

猪生殖与呼吸综合征病毒NM1株的分离鉴定及其Nsp2基因的序列分析

从内蒙古某猪场患高热症病猪病料中分离到1株病毒,该病毒能在Marc-145细胞上增殖,产生细胞病变.经RT-PCR法鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,将其命名为NM1.应用设计的特异性引物扩增NM1株的Nsp2基因,并与国内外PRRSV分离株的Nsp2基因序列进行了比较.结果表明,NM1株Nsp2基因推导的氨基酸序列出现30个不连续的缺失,与PRRSV高致病性毒株HUN4、HuB2、JXA1的核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.0%和98.9%.动物回归试验结果显示,人工感染的5头仔猪全部发病,其中3头死亡,说明NM1株为发生变异的PRRSV,其致病力有所增强.     

2006～2008年重庆部分区县PRRSV分离株ORF5和Nsp2基因的遗传变异分析

为了解重庆市PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2006～2008年分离到的14株重庆市内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和0RF5基因序列的测定和分析.结果显示,与2006年以来国内流行的变异毒株相比,Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到97.3%～99.5%和98.2%～99.7%,这2个基因推导的氨基酸序列同源性分别达到95.7%～99.2%和98.0%～99.5%.与传统毒株相比,Nsp2和ORF5基因及其推导的氨基酸都存在点突变,并在Nsp2基因内部存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失,ORF5基因未存在缺失.从遗传进化以及变异情况看,重庆市流行的PRRSV主要为变异毒株,属于美洲型中的亚群Ⅱ.     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

稳定表达PRRSV ORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌的构建及其生物学特性

为构建能稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌,以p MD19-T-ORF5-7为模板,PCR分别扩增出ORF5和ORF6,将2个基因先后插入表达载体PYA3493,构建了重组质粒PYA3493-ORF5-ORF6。PCR、双酶切及测序结果表明,成功构建了重组质粒p YA3493-ORF5-ORF6。将该重组质粒电转至减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1基因缺失株,获得PRRSVORF5-ORF6融合基因重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6),并对该重组减毒猪霍乱沙门菌的生长特性、遗传稳定性和表达特性进行了测定。进一步对重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)研究发现,其生长速度比强毒株C78-1明显减慢,与ΔcrpΔcyaΔasd C78-1缺失株及ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493)互补菌株基本一致。在体外连续传代能够稳定遗传ORF5-ORF6融合基因。重组菌培养上清经SDS-PAGE能检测到ORF5-ORF6蛋白条带,且经Western-blot分析证实,重组菌共表达的GP5和M蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。以上结果表明,能稳定携带ORF5-ORF6融合基因的重组减毒猪霍乱沙门菌ΔcrpΔcyaΔasd C78-1(p YA3493-ORF5-ORF6)构建成功,为开发猪繁殖与呼吸综合征和仔猪副伤寒基因工程二联疫苗奠定了良好基础。     

河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒的变异分析

为了解河北省规模猪场猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况,采用RT-PCR方法对2004～2007年采集的12个典型发病场的病料样本进行了PRRSV Nsp2和ORF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar和DNAMAN软件对所测序列进行了分析.结果显示,扩增的ORF5基因氨基酸序列同源性为98.7%～100%,与美洲型和欧洲型PRRSV参考株的同源性分别为88.9%～100%和62.9%～63.5%;扩增的Nsp2基因氨基酸序列同源性为82.8%～100%,与参考毒株的同源性为76.5%～100%;从2006~2007年的样本中扩增的6个PRRSV Nsp2基因均在第481位和533~561位共缺失30个氨基酸;系统进化树分析表明,这6个样本株均属于美洲型,分属于2个基因亚群,其中HB0503株与BJ4、NJ1、HN1、LP1和VR-2332遗传关系较近,其他株与JXA1、SX和BJ株遗传关系较近.结果表明,危害河北省规模猪场的PRRSV已经发生了较大的变异,其中2004～2005年的样本株属低致病性PRRSV毒株,而2006～2007年的样本株属高致病性PRRSV毒株.     

猪生殖与呼吸综合征病毒N基因的扩增与克隆

应用RT PCR方法扩增出猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)的核衣壳蛋白基因 (N基因 ) ,并将其克隆到 pET 32a载体 ,构建了高效原核表达载体pETN。将 pETN重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌后 ,对插入片段进行了序列测定及同源性分析。结果表明 ,插入片段序列与PRRSV美洲型ATCCVR2 332株的ORF7核苷酸序列同源性达 99.9% ,与分离毒株的同源性达 99.0 %。     

广西地区2004-2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5及ORF7基因的遗传变异分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子遗传进化情况,对2004-2010年间广西的PRRSV阳性病料进行了ORF5、ORF7基因扩增和序列分析。结果显示,所获得的毒株均属于美洲型毒株,其ORF5基因间的氨基酸序列同源性为89.6%～99.5%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为84.6%～91%、89.6%～95.5%和93%～99%,而与LV的同源性为54.7%～56.7%;ORF7基因间的氨基酸序列同源性为87.1%～99.2%,与VR-2332、Ch-1a、JXA1株的氨基酸序列同源性分别为91.1%～96%、91.9%～96%和89.5%～99.2%,而与LV的同源性为55.6%～58.1%。基于ORF5和ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树,可将所有PRRSV分离株分为4个亚群,广西地区的毒株分布在以CH-1a为代表的Ⅱ亚群、以HB-1为代表的Ⅲ亚群和以JXA1为代表的Ⅳ亚群,以Ⅳ亚群为主。表明当前广西PRRSV流行毒株以美洲型Ⅳ亚群为优势基因亚群,并且各毒株间的ORF5和ORF7基因序列存在一定差异,但没有明显的地域特征。     

PRRSV间接免疫荧光检测法的建立和应用

以猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ATCC VR 2332 株人工单独感染3 头3 周龄仔猪,并用PRRSV ATCC VR 2332株和猪圆环病毒2型(PCV2)联合感染2 头3 周龄仔猪,每日检查试验猪体温、采食情况及临床表现,并用HerdChek IDEXX 试剂盒测其血清抗体。PRRSV PCV2联合感染猪分别在感染后1、3周剖杀,PRRSV单独感染猪和健康对照猪分别在感染后1、2和3周剖杀,对全部试验猪的肺组织进行灌洗处理以获得肺泡巨噬细胞(PAM),用PAM进行抹片,同时用肺组织直接进行触片做间接免疫荧光(IIF)检测。结果表明,用所获得的3 株单克隆抗体均检测到人工感染猪肺组织中的PRRSV抗原。另外,用IIF检测7 头临床疑似PRRS病猪的PAM抹片,其中沭阳县的2头猪呈现阳性反应;对这2头猪的肺组织进行病毒分离,在盲传到第4代时Marc 145细胞上产生明显的细胞病变,进一步证实用所获得的3株单克隆抗体检测临床样品的结果准确而可靠,且获得的3株单克隆抗体均可通过IIF用于检测猪肺组织中的PRRSV抗原。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR株不同代次水平的毒力比较试验

为了阐明高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HBR毒株在体外传代过程中发生的毒力及遗传变异情况,采用第5、10和125代PRRSV-HBR株病毒进行了人工感染试验。结果显示,低代次(第5和第10代)病毒接种组可复制出以"高热综合征"为特点的症候群,第5代毒株感染组死亡率达40%(2/5),第10代感染组症状明显减轻且无死亡,第125代毒株感染组基本无临床症状。这3个代次的毒株感染组于感染后第3天检测病毒血症呈阳性,第7～14天到达高峰,第125代于第21天消失,较第5和10代毒株提前1周。病毒感染后抗原主要分布于脾、扁桃体、淋巴结等组织,第5和10代毒株感染组脏器出现严重的病理损伤,第125代毒株感染组仅见轻微病理损伤。对3个代次毒株的ORF5、ORF6和ORF7测序显示,仅在ORF5出现了3个氨基酸位点突变,即第29位:第5、第10代的缬氨酸到了第125代变为丙氨酸;第32位:第5、第125代的丝氨酸到了第10代变为甘氨酸;第196位:第5、第10代的谷氨酰胺到了第125代变为精氨酸。研究表明,低代次毒株能够完全复制出典型的"猪高热综合征",而高代次毒株无明显临床症状,证明该毒株经细胞传代后毒力下降。高代次毒株感染动物仍能够引起毒血症和持续感染的结果表明,高代次毒株仍具一定毒力,作为疫苗种毒需要进一步毒力弱化。     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白糖基化位点缺失突变株的构建

以含有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332株全长感染性cDNA克隆的质粒pVR2332为模板,通过融合PCR方法扩增GP5蛋白第34、51位天冬酰胺糖基化位点缺失的突变序列,替换pVR2332质粒中编码GP5蛋白的DNA片段,分别获得重组质粒pVR-N34A、pVR-N51A。在体外转录后转染BHK-21细胞,转染后第48小时收集细胞接种Marc-145细胞,进行突变病毒的拯救。然后通过RT-PCR扩增拯救病毒GP5蛋白的编码序列,序列分析显示构建正确。间接免疫荧光试验证明拯救病毒能够正常表达GP5蛋白。同时,中和试验结果初步表明GP5糖基化位点缺失影响PRRSV与中和抗体的反应。猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白不同糖基化位点缺失突变株的获得将为进一步揭示GP5蛋白糖基化与诱发机体免疫反应之间的关系奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。