细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原、原头节、囊液及囊壁抗原的二维电泳分析

应用二维电泳、考马斯亮蓝G-250染色对细粒棘球绦虫六钧蚴排泄分泌抗原、原头节、绵羊及牦牛棘球蚴囊液以及囊壁抗原进行了初步分析。结果5种抗原分别显示多肽斑点108、64、85、124及83个;其中特异斑点分别为44、40、46、87及37个。对六钩蚴ES抗原多肽斑点的分析尚属首次。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原的免疫原性

本实验应用体外培养方法制备细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌(ES)抗原,将其与弗氏不完全佐剂乳化后免疫绵羊2次,最后一次免疫后2周每只试验绵羊攻击1000枚虫卵,攻击后7个月剖杀试验羊观察肝肺包囊寄生情况。结果表明六钩蚴ES抗原具有很好的免疫原性,诱导的免疫保护力(减囊率)达96.04％;混合抗原为93.39％,囊液抗原为76.21％,囊壁抗原为30.62％。免疫后试验羊的抗体滴度与免疫保护力之间存在正相关关系。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——六钩蚴排泄分泌抗原及原头节可溶性粗抗原的SDS-PAGE

本文应用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)首次对细粒棘球绦虫六钩蚴排泄分泌(ES)抗原的多肽组分进行了分析并同时对牦牛源棘球蚴原头节可溶性粗抗原的多肽组分进行了分析。应用10％凝胶,采用垂直板型电泳、考马斯亮蓝R-250染色进行SDS-PAGE的结果表明,六钩蚴ES抗原至少由14种多肽组分组成,分子量范围270～17.5KD,其中主要组分6种。原头节可溶性粗抗原至少由25种多肽组分组成,分子量范围230～17KD,其中主要组分13种。本项研究为功能性抗原的进一步分析、分离奠定了基础。     

三种绦虫蚴囊液抗原的SDS-PAGE分析

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对绵羊棘球蚴囊液和原头节抗原分析结果表明，前者共有多肽带１９条，其中６６和５９ｋｕ多肽带为主带；后者共有多肽带２９条，缺乏主带成分。这两种抗原在多肽组成和含量方面差异明显。绵羊细颈囊尾蚴囊液和脑多头蚴囊液抗原的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果表明，前者共有多肽带１５条，其中主带成分为６６，５９，４０和１２．５ｋｕ多肽带；后者共有多肽带１３条，其中６６，４０和１２．５ｋｕ多肽带为主带。三种绦虫蚴囊液抗原之间的共有成分为９４，６６，５９，４３和４０ｋｕ多肽带。棘球蚴囊液的４２，３４．５，３３和２４．５ｋｕ多肽带组分也为细颈囊尾蚴所共有，而５５，５２，４１，３９，３８．５，１４ｋｕ以及１条分子质量小于１０ｋｕ的多肽带为棘球蚴囊液的特异性组分     

棘球蚴囊液抗原A和B在酶联免疫吸附试验中的应用比较

用醋酸缓冲液和４０％饱和硫酸铵连续沉淀法从绵羊棘球蚴囊液（ＳＨＣＦ）中得到部分纯化抗原（ＳＰＰＣＦ），并从中分离了抗原Ａ和抗原Ｂ，分别用单克隆抗体反向间接血凝试验（Ｍ－ＲＰＨＡ）、单克隆抗体双扩散试验（Ｍ－ＤＤ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）进行了鉴别，表明自制的三株单克隆抗体（ＭｃＡｂ）均识别ＳＨＣＦ、ＳＰＰＣＦ及抗原Ｂ，而不识别抗原Ａ；用ＥＬＩＳＡ对阳、阴性血清检测，ＳＰＰＣＦ、抗原Ａ和抗原Ｂ的阳性检出率分别为８３．３３％、８３．３３％和７５％，阴性符合率分别为７２．２２％、８６．１１％和７５％，表明抗原Ａ的敏感性和特异性均优于ＳＰＰＣＦ和抗原Ｂ。     

细粒棘球绦虫重组EG95抗原在绵羊绦虫蚴病血清抗体检测中的应用

为了分析评价细粒棘球绦虫重组蛋白EG95(rEG95)在血清抗体检测上的效果,以细粒棘球绦虫EG95重组质粒pGEM-EG95为模板,经PCR扩增后将目的片段亚克隆至pET-28a(+),构建重组表达载体pET-EG95,在大肠杆菌BL21中表达,SDS-PAGE分离和电洗脱纯化重组表达产物rEG95。建立重组蛋白间接ELISA方法,检测绵羊带绦虫蚴病血清抗体水平。结果表明,表达产物经SDS-PAGE测定分子质量为21ku左右。该蛋白可被棘球蚴病阳性血清特异性识别,表明该表达产物具有反应原性。应用该重组蛋白间接ELISA检测18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、20份棘球蚴感染绵羊血清,24份疫苗抗原rEG95免疫羊血清和来自棘球蚴病疫区的179份绵羊血清,其阳性检出率分别是66.67%、80.00%、100%、91.67%和58.2%,而14份健康羊血清反应为阴性,组间差异有一定统计学意义(P<0.05)。表明EG95蛋白可作为绵羊带绦虫蚴病共同保护性抗原和诊断抗原而加以应用。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——原头节排泄分泌抗原的免疫原性

本文首次在绵羊阐明了细粒棘球绦虫原头节排泄分泌(ES)抗原及原头节可溶性粗抗原的免疫原性。应用体外培养技术制备原头节ES抗原,用超声波粉碎法制备原头节可溶性粗抗原。将抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化后经肌肉及皮下分两次免疫绵羊,最后一次免疫后14天攻击感染细粒棘球绦虫虫卵1000枚,攻击感染后7个月剖检试验羊。结果表明,原头节ES抗原在绵羊诱导的免疫保护力(减囊率)达92.07％,原头节可溶性粗抗原为74.89％。本实验还观察了血清抗体应答、T细胞应答与免疫保护之间的关系。     

细粒棘球绦虫六钩蚴静脉感染小鼠模型动物的建立

利用绵羊-犬源细粒棘球绦虫的六钩蚴尾静脉注射感染昆明小鼠10只,每只接种六钩蚴600枚.结果,在接种后62-83 d内小鼠全部死亡,剖检死亡小鼠其荷囊量为2-40个.     

绵羊棘球蚴囊液抗原在IHA中的特异性研究

本研究应用粗制绵羊包囊液作抗原致敏经戊二醛处理的鞣酸化绵羊红细胞,进行微量间接血凝试验(IHA),检测棘球蚴病羊血清400份、健康羊血清45份、细颈囊尾蚴病羊血清13份、肝片吸虫病羊血清21份、边虫病羊血清20份、多头蚴病羊血清1份,阳性反应率依次为83.1％、13.33％、33.46％、4.35％、0％、0％。以40％饱和硫酸铵盐析抗原对上述健康羊血清、细颈囊尾蚴病羊血清及96份棘球蚴病羊血清的检测结果依次为13.33％、38.46％、87.5％。对分段盐析的其他组份及葡聚糖凝胶层析抗原、醋酸盐析抗原、牦牛肺包囊液抗原、鼠包囊液抗原也进行了初步试验,均未获得满意结果。     

分泌抗细粒棘球蚴原头节可溶性抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用SP2／0骨髓瘤细胞与以羊源细粒棘球蚴原头节可溶性抗原（SPA）免疫的Balb／c鼠脾细胞融合，经克隆和筛选后获得8株分泌抗SPA的杂交瘤细胞株，即3A_4、1IC_2B_3、2C_2、2E_3、3E_6、3F_(10)和3C_2。亚类鉴定为IgG_1（3A_4、3E_6、1C_2、3F_(10)和3C_2）、IgG_2b（2C_2)、IgG_3(2E_3）、IgG总（2B_3）。免疫双扩散法显示2C_2腹水及2B_3、2C_2、2E_3培养上清粗提物与SPA有反应，与细粒棘球蚴囊液（SHF）抗原及细颈囊尾蚴抗原（CtAg）无反应，以WesternBlot证实3A_4、2C_2、3C_2在SPA50KDa处有强反应带，但对SHP和CtAg亦有微弱反应。依赖于补体的杀伤试验及ADCC实验，提示这些单抗在寻求保护性抗原方面具有一定研究价值。     

分泌抗细粒棘球蚴原头蚴抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用感染包虫的绵羊肝包囊中的活原头蚴腹腔接种ＢＡＬＢ／Ｃ鼠，８个月后取鼠脾细胞与Ｓｐ２／Ｏ骨髓瘤细胞融合。经ＩＨＡ筛选，获得１４个阳性杂交瘤细胞株，对其中３林进行了克隆和进一步研究。结果表明，ＳＣ＿５与细颈囊尾蚴、脑包虫和肝片吸虫抗原均不发生交叉反应，腹水抗体的ＩＨＡ效价为１：２０４８，属ＩｇＧ＿２ｂ亚类：３Ｃ＿５和６Ｃ＿４与细颈囊尾蚴和脑包虫有轻度交叉反应，腹水抗体的ＩＨＡ效价为１：１２８，均属ＩｇＭ类。     

分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

用羊肝囊液纯化抗原免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化培养,获得3株分泌McAb的杂交瘤细胞株1D_3、3H_(11)和9E_(11)。3株McAb均属IgG_1亚类,能与人源和羊源的细粒棘球蚴囊液抗原反应,不与细颈囊尾蚴、肝片吸虫、脑包虫或弓形虫抗原反应。腹水中抗体的IHA最高效价可达2~(-13)。杂交瘤细胞经冻存、复苏和连续传代培养,分泌抗体性质稳定。     

细粒棘球绦虫排泄分泌抗原研究——绵羊牦牛棘球蚴囊液几项生化指标的比较

本文应用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦(IEF)电泳首次对绵羊、牦牛棘球蚴囊液的蛋白质、糖、脂及酯酶同功酶进行了初步分析。结果表明,用考马斯亮蓝R-250染蛋白质分别显示38及36条带;用RAS染糖,分别显示19及22条带;用Nile＇s蓝染脂,均显示7条带;用坚固蓝染酯酶同功酶,分别显示20及10条带。两者上述几项生化指标的差异是宿主特性不同的一个反映。本项研究为进一步阐明绵羊、牦牛棘球蚴囊液的生化特性积累了资料。     

亲和层析纯化棘球蚴囊液特异性抗原的研究

本文应用兔抗健康羊IgG吸附柱、兔抗羊细颈囊尾蚴IgG吸附柱分别对绵羊棘球蚴囊液粗抗原进行了亲和吸附,制得了亲和纯抗原,并用ELISA法测定其抗原性。试验表明,经过兔抗羊细颈囊尾蚴IgG吸附柱吸附后的抗原,与非疫区绵羊血清反应的OD值都低,而与疫区血清反应的OD值都较高。经过兔抗健康羊IgG吸附柱吸附后,在不影响阳性检出率的情况下,可以降低阴性血清所致的假阳性反应,同时提高了细颈囊尾蚴的检出率。     

西藏家畜三种绦虫蚴病感染情况的调查

采用剖检法检查西藏五县147只山羊、118只绵羊、114头牦牛、88头黄牛内脏器官、网膜、肠系膜、脑等组织器官,采集寄生虫幼虫,调查西藏家畜主要带科中绦期幼虫(细颈囊尾蚴、棘球蚴、脑多头蚴)的感染情况和危害程度。结果显示,山羊细颈囊尾蚴、棘球蚴、脑多头蚴的总体感染率分别为46.94%、4.08%、0,绵羊分别为62.77%、13.83%、4.26%;牦牛棘球蚴、脑多头蚴的感染率分别为15.79%、2.63%,黄牛的感染率分别为4.55%、0,说明绵羊更易感脑多头蚴;截至目前暂未在西藏发现山羊感染脑多头蚴;牦牛感染率幼畜与成年畜间差异极显著(P0.01),说明幼畜更易感。结果表明,西藏家畜这三种绦虫蚴病感染强度仍很高,需开展深入研究,加强寄生虫病防控工作。     

多头绦虫抗原特性的研究——原头节及其排泄分泌抗原的免疫原性

应用多头蚴原头节可溶性抗原和将原头节进行体外短期培养后获得的排泄分泌（ＥＳ）抗原，以４ｇ／Ｌ抗原量与等体积的白油－司班佐剂乳化后，按每次２ｍＬ剂量对试验羔羊进行３次免疫。于最后一次免疫后２周，攻击感染２５００个多头绦虫虫卵，攻击后２２５ｄ剖杀各组羔羊。结果感染对照组羔羊全部感染了多头蚴，所含原头节为圆形或椭圆形，大小为０．３９０～０．４１０ｍｍ×０．３９５～０．４１５ｍｍ。原头节可溶性抗原及其ＥＳ抗原免疫组有２／３羔羊获全保护；１／３羔羊未能获保护，但其多头蚴包囊的大小、原头节数目及大小均小于感染对照组。     

多头绦虫抗原特性的研究——绵羊免疫后及感染后的抗体消长规律

用多头绦虫原头节、囊壁、囊液层析纯化抗原及原头节排泄分泌（ＥＳ）抗原对绵羊免疫及攻击感染多头绦虫虫卵后的血清进行ＥＬＩＳＡ检测，观察了血清抗体的消长规律。结果表明，绵羊在感染虫卵后第１周即可检测出血清抗体，感染后３～５周抗体效价达到峰值，一直持续到试验结束；免疫组绵羊在免疫３次后，血清抗体效价迅速升高，第３次免疫后１～２周达到峰值，且抗体水平明显高于虫卵感染组，在攻击虫卵后抗体效价开始下降，但直到试验结束时抗体效价仍维持在较高水平。原头节可溶性抗原免疫组和原头节ＥＳ抗原免疫组血清抗体总体水平要高于囊壁和囊液抗原免疫组，原头节ＥＳ抗原和原头节层析纯化抗原的敏感性、特异性要高于囊壁和囊液层析抗原。试验表明，以上４种抗原可用于ＥＬＩＳＡ检测绵羊免疫及感染后的抗体应答反应。     

绵羊绦虫蚴囊液的SDS─PAGE分析

由于绵羊棘球蚴囊液（EgCF）取材相对方便具有较强的抗原活性，是诊断棘球蚴病抗体的较好抗原，但因EgCF成分复杂，在免疫诊断中有时与其它绦虫蝴病抗体发生免疫交叉反应。为查明绵羊棘球蚴和其它绦虫蚴抗原组分的异同，本文在分子水平上比较了细粒棘球蚴囊液细颈囊尾蚴囊液（CtCF）和多头蚴囊液（CcCF）可溶性蛋白多肽的异同。（一）材料与方法1.样品的制备：（1）EgCF：无菌抽取自然感染绵羊肝脏棘球蚴包囊液，5000r／min离心20min，取上清，PEG浓缩至1／10，蒸馏水透析除盐，经紫外吸收法测定其蛋白含量为2.4mg／ml，分装，-20°…     

细粒棘球绦虫六钩蚴EG95抗原基因的克隆及原核表达

利用RT PCR从激活的细粒棘球绦虫六钩蚴中扩增了EG95 cDNA,并亚克隆至原核表达载体pGEX 4T 1上,转化至大肠埃希氏菌BL21,用IPTG诱导重组菌株表达了融合蛋白质。结果表明,从六钩蚴中克隆到了EG95 cDNA,序列长度为481 bp,包括471 bp的开放阅读框,与新西兰株EG95抗原基因序列完全一致;SDS PAGE电泳结果显示,重组表达质粒产生了约42 ku的目的带,其中EG95蛋白质的分子质量约为15.2 ku,与预期结果一致;Western blotting试验检测表明,融合表达产物可与囊性包虫病人血清发生反应。试验结果提示,EG95 基因高度保守,所表达的EG95蛋白作为抗原疫苗具有广泛的适用性。     

甘肃省家畜棘球蚴病综合防治效果调查

以甘肃省的天祝县、环县和漳县的９个乡为家畜棘球蝴病综合防治试点。在完成流行病学基线调查的基础上，采用单相灭绝病原模式，用毗喳酮药饵对试验区的所有犬每月进行一次高密反无污染性驱虫，并在年对防治效果进行监测。经过两年半（２９个月）的综合防治，使三县试，点内大的细粒棘球绦虫平均后来率由１９９１年的３４．３２％下降到１９９３年的０１家畜（牛、羊、猪）棘球蚴病的平均感染率由５６．８１％降为９．２５％；绵羊的间接血凝（ＩＨＡ）阳性率由７９．４７％降为３５．５６％；天祝县１岁绵羊的棘球蝴病感染率由１９９１年的９８．４６％下降到１９９３年的２８．５７％，脱感率达７０．９８％；２岁羊的感来率由８５．８７％下降为３３．３３％，脱感率为６１．１９％。