多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体 (MG)、滑液囊霉形体 (MS)、衣阿华霉形体 (MI)和火鸡霉形体 (MM )的基因文库 ,设计了 4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果 ,均同时得到了 4条特异性的大小与试验设计相符的 732bp(MG)、2 0 7bp(MS)、2 99bp(MI)、85 0bp(MM )多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明 ,此多重PCR能同时检出 1pg的MG、MS、MI和MMDNA模板     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体 16SrRNA的基因序列设计、合成了 1对引物 ,用这对引物对鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisep ticum ,MG)和鸡滑液囊霉形体 (Mycoplasmasynoviae ,MS)菌株DNA进行PCR扩增 ,得到了与预期大小相一致的约 5 80bp的PCR产物 ,而这对引物对其他禽病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性。PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为 2 pg和 3pg。应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品 ,从人工感染样品中均检测到MG ,临床样品的MG阳性检出率为 10 .2 5 % ,高于常规分离培养的阳性检出率     

水貂肠炎病毒疫苗株和野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立

为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发现,疫苗毒MEVB株NS1基因核苷酸1401位的碱基由T变为C,致使1399位～1404位的核苷酸构成由ATTGAT变异为ATCGAT,多了1个限制性内切酶ClaⅠ酶切位点,其他MEV分离毒株中均未出现此酶切位点。用特异性引物扩增出2 013bp的目的片段后,再用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切分析,疫苗毒MEVB株被切割成1 404bp和609bp的2个片段,国内其他分离株均未出现上述片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗毒MEVB株和野毒株。     

应用PCR-RFLP分析鉴别广西鸡毒霉形体

针对鸡毒霉形体 (MG) 16S和 2 3SrRNA基因间的高变区序列设计合成了 1对引物 ,对MG菌株进行了PCR扩增 ,获得了 1条 899bp的DNA片段 ,而其他禽病病原DNA无扩增。扩增产物经用限制性内切酶AfaⅠ和DraⅠ进行酶切片段长度多态性分析 ,表明各MG菌株酶切图谱间均存在差异。     

二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法的建立

设计了 6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒 (IBV )、禽流感病毒 (AIV)、鸡毒霉形体 (MG )、鸡传染性喉气管炎病毒 (ILTV )、新城疫病毒 (NDV)和滑液霉形体 (MS)的特异性引物 ,根据反转录聚合酶链反应 (RT PCR)原理和多重PCR原则 ,优化建立了一次PCR反应同时检测 6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR。该方法可同时扩增出 6条区段大小与设计相符的特异性片段 ,即IBV 172 0bp、AIV 10 5 0bp、MG 73 2bp、ILTV 64 7bp、NDV 3 10bp、MS 2 0 7bp ,对人工感染鸡临床样品检测结果证明 ,该方法可用于临床诊断。     

二温式多重PCR同时检测鸡的6种呼吸道病病原方法建立

设计了6对分别针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、禽流感病毒(AIV)、鸡毒霉形体(MG)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、新城疫病毒(NDV)和滑液霉形体(MS)的特异性引物,根据反转录聚合酶链反应(RT-PCR)原理和多重PCR原则,优化建立了一次PCR反应同时检测6种禽呼吸道病原的二温式多重PCR.该方法可同时扩增出6条区段大小与设计相符的特异性片段,即IBV 1720 bp、AIV 1050 bp、MG 732 bp、ILTV 647 bp、NDV 310 bp、MS 207 bp,对人工感染鸡临床样品检测结果证明,该方法可用于临床诊断.     

丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma mycoidessubsp.capri,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他病原菌不能扩增出任何条带,它最低能够检测出10 pg的Mmc DNA,说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示,对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段,表明,该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。     

山羊痘弱毒疫苗株TK基因的克隆及序列分析

以提取的山羊痘弱毒疫苗株HLJ-V9 DNA为模板,设计特异性引物并进行PCR扩增,获得了2078 bp的DNA片段,并将PCR产物克隆至pGEM-T Easy载体。酶切鉴定、PCR鉴定和测序结果表明,成功获得了TK基因,获得的TK基因内存在一个KpnⅠ酶切位点和编码区的早期转录终止信号TTTTTN(T)T。核苷酸和氨基酸同源性分析表明,弱毒疫苗毒株HLJ-V9 TK基因与参考毒株的同源性在95.5%~100%之间,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性。     

用RAPD技术分析鸡毒霉形体广西分离株的DNA多态性的研究

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术 ,以随机引物成对组合的方式对鸡毒霉形体(MG) 5株广西分离株和 3株标准株DNA进行了多态性分析。结果显示 ,所选用的 2 0条引物中 ,有 3对 (6条 )引物扩增的条带为 2～ 10条 ,大小在 2 0 0～ 30 0 0bp。相似指数分析显示 ,广西MG分离株Y2与WL、CH与Y3的相似指数最高 ,分别为 0 .92和 0 .86 ,其与H2的相似指数为 0 .36～ 0 .6 2。 3株MG标准毒株S6、K2 2 2 1、K15 0 1与广西分离株间的相似指数为 0 .17～ 0 .5 7。表明广西流行的MG与MG标准株存在差异 ,当地的流行株也呈现多样性     

采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究

建立了检测鸡喉气管炎病毒(ILTV)的二温式聚合酶链反应(二温式PCR),根据已报道的ILTV TK基因的序列,设计并合成了1对引物,用二温式PCR对5株不同ILTV DNA进行扩增.该对引物对5株ILTV DNA均扩增出与预期大小相一致的647 bp的扩增产物,而对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽沙门氏菌、鸡毒霉形体和禽巴氏杆菌等6种禽病病原体的扩增,结果全部为阴性.该二温式PCR可检测到1fg的ILTVDNA模板,其敏感性比常规三温式PCR高1万倍.     

应用多重聚合酶链反应检测鸡毒霉形体和滑液霉形体的研究

根据鸡毒霉形体（ ＭＧ） 、滑液霉形体（ ＭＳ） 的基因文库,设计并合成了分别与ＭＧ、ＭＳ 某段基因序列互补的两对引物,用这两对引物进行多重聚合酶链反应（ ＭｕｌｔｉＰＣＲ） 同时检测ＭＧ 与ＭＳ。当样品中同时含有ＭＧ 和 ＭＳ 的目的模板ＤＮＡ 时,均同时得到２ 条大小与试验设计相符的７３２ ｂｐ（ ＭＧ） 和２０７ ｂｐ （ ＭＳ） 的ＰＣＲ 扩增带;而对其它８ 种禽病病原的扩增均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重ＰＣＲ 技术最低能同时检出１００ ｆｇ 的ＭＧ、ＭＳ ＤＮＡ 模板量     

产蛋下降综合征病毒PCR检测方法的建立

根据已报道的腺病毒DNA序列 ,设计合成了 1对核苷酸引物 ,引物间隔约 63 0bp。用该引物对EDS76病毒内蒙古分离株 (N3 ,N4 )和参考株 (AV 1 2 7)核酸进行聚合酶链式反应 (PCR)。结果 ,均扩增出了约 63 0bp的特异性DNA片段。所建立的PCR方法可检出 1 0 0pg的样品模板。结果表明 ,此PCR方法是检测EDS76病毒的一种简便快速、特异性强和灵敏度高的方法     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

嗜肾型鸡传染性支气管炎W93株活疫苗的研究及其S1基因的克隆与序列测定

利用鸡胚分离法由发生肾病变型传染性支气管炎 (IB)的病鸡分离到嗜肾型传染性支气管炎病毒 (NIBV)W株 ;再通过SPF鸡胚连续传代 ,获得了NIBV疫苗毒株W93;继而借助RT PCR法扩增了其S1基因 ,并测定了S1基因的核苷酸序列 ,分析了与相关毒株间的同源性。结果显示 ,W93株在鸡胚中的病毒产量达 10 7.8EID50 /0 .1mL ,适用于所有日龄的雏鸡 ;W93S1基因的核苷酸序列与马萨诸塞型的M4 1株、H52 株和H12 0 株的同源性很高 ,分别为 96 .9%、96 .8%和 97.1%。表明 ,W93可作为制备IB弱毒疫苗的毒株