口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

牛病毒性腹泻病毒Erns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns基因的生物学功能,将含有牛病毒性腹泻病毒 Erns基因的质粒pMD18-T-Erns经BamH I／HindⅢ双酶切,获得了Erns片段,再与杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A连接,构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns与Bac-N-BlueTM DNA 共转染至sf9昆虫细胞中,获得了重组病毒,经噬斑筛选纯化,感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS- PAGE分析结果表明,表达的目的蛋白大小约30 ku;Western-blotting检测表明,该蛋白具有良好的抗原性。     

禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因在杆状病毒中的表达及其产物的活性分析

以质粒pMD18T-env为模板,利用PCR技术扩增禽网状内皮组织增生病病毒的gp90基因,酶切、纯化后,克隆至载体pFastBacHTA中,构建了重组供体载体pFgp90,并将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体Bacmidgp90.通过脂质体介导将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp90.抗gp90蛋白小鼠超免疫血清介导的Western-blot分析和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,gp90蛋白被正确表达,分子质量约为45 ku;gp90蛋白在变性和自然状态下均能够被识别,具有良好的生物活性.     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

鸭肝炎病毒VP1和VP3基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

为了构建鸭肝炎病毒VP1和VP3结构蛋白基因的杆状病毒表达载体,以RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒的VP1和VP3基因,克隆至pGEM-T载体。经筛选测序验证后,以BamHⅠ+XhoⅠ双酶切回收VP1和VP3目的片段,与经相同方法处理的杆状病毒转座载体pFastBac1连接,得到重组质粒pFastBac1-VP1和pFastBac1-VP3。将经酶切及测序鉴定的阳性重组质粒转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选,成功获得各自携带VP1和VP3基因的重组穿梭载体,将其命名为rBacmid-VP1、rBacmid-VP3。研究结果为进一步在昆虫细胞中表达VP1或VP3基因,开发研制鸭肝炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.将重组质粒转染BHK-21细胞.间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达.Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符.表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性.     

犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及其真核表达

为构建犬新孢子虫NcAMA1基因重组腺病毒穿梭质粒,并在真核细胞中表达,以重组质粒pVAX1-NcAMA1为模板,PCR扩增了NcAMA1基因,以此构建了pMD18T-NcAMA1重组克隆质粒;对该重组克隆质粒进行双酶切鉴定后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体pCR259中。应用脂质体介导转染法将经PCR鉴定和酶切鉴定正确的pCR259-NcAMA1重组穿梭质粒转染293细胞,应用IFAT和Western-blot技术检测了AMA1基因在293细胞中的表达情况。结果显示,扩增的NcAMA1基因长度为1 695bp,构建的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-NcAMA1能在293细胞中获得瞬时表达,表达蛋白的分子质量约为68ku。     

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

番鸭细小病毒样颗粒的制备与鉴定

为在昆虫细胞中表达番鸭细小病毒主要结构蛋白VP3,并探讨重组蛋白VP3能否在昆虫细胞中自动组装成病毒样颗粒,高保真扩增VP3基因,克隆入杆状病毒转移载体pFastBac1中,获得重组转移质粒pFB-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定,得到重组Bacmid DNA。将其转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒rBac-VP3,利用SDS-PAGE、Western-blot、间接免疫荧光试验对重组蛋白的表达情况进行检测,负染电镜观察病毒样颗粒,并通过Western-blot对病毒样颗粒进行鉴定。SDS-PAGE和Western-blot结果表明重组蛋白大小正确。间接免疫荧光试验结果显示,重组蛋白获得了成功表达。利用负染电镜可观察到直径约20 nm的典型二十面体病毒样颗粒。Western-blot结果显示该病毒样颗粒由VP3蛋白组成。本研究首次成功利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统制备了番鸭细小病毒样颗粒,为番鸭细小病毒病新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT PCR技术 ,用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株 (China/99 2 )中扩增得到一约 75 0bp的DNA片段 ,克隆后 ,经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较 ,显示其与国外同源参考序列 (O1K/66)的同源性为 80 .44% ,与国内同型参考株 (HB/WH/99)的核苷酸序列的同源性达 99.0 6%。随后以重组质粒pGEM VP1为模板 ,用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1 (65 0bp) ,对目的基因和表达载体 pGEX 4T 1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体 ,转化宿主菌BL2 1 (DE3 )后得到重组质粒pGEX VP1 ,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳、Western blotting分析检测。结果表明 ,结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达 ,表达产物的分子量约为 5 3ku ,并能被口蹄疫阳性血清所识别。经薄层扫描分析 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .0 0 %。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达 ,且表达产物有一定的生物学活性     

双峰驼CYP2J基因的克隆与原核表达载体的构建

CYP2J酶主要参与机体内源性物质代谢,尤其是对花生四烯酸和亚油酸代谢发挥着重要作用。本试验通过克隆CYP2J基因,构建其原核表达载体,为蛋白层面深入研究双峰驼CYP2J酶提供特异性抗体奠定基础。从双峰驼肾组织提取RNA,反转录后PCR扩增出双峰驼CYP2J基因,胶回收纯化后进行TA克隆,连接pMD18-T质粒并转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞中,提取质粒进行HindⅢ和KpnⅠ双酶切和PCR鉴定,并借助上述内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CYP2J后,连接于经同样双酶切处理的原核表达载体pET-32a,转化于大肠杆菌DH5α细胞中,并经HindⅢ和KpnⅠ双酶切、PCR鉴定及测序鉴定重组质粒。结果表明,在重组质粒pMD18-T-CYP2J和pET-32a-CYP2J双酶切电泳中均能得到约1500bp的特异性目的条带及两种质粒的特异性条带。以2种重组质粒为模板进行PCR扩增后电泳均能得到约1500bp的CYP2J特异性条带,测序结果与GenBank中公布的双峰驼CYP2J预测序列的相似度为99%。由此可见,本试验成功构建了双峰驼CYP2J基因原核表达载体pET-32a-CYP2J,为后续该基因的高效原核表达和蛋白层面的研究奠定了基础。     

O型FMDV VP1基因的真核表达及其产物的生物学活性

根据已克隆的O型口蹄疫病毒VP1基因序列,设计了1对带有SacⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,用其将pMD18-T-VP1质粒中的VP1基因亚克隆到真核表达载体pBlueBacHis2A中,成功地构建了重组表达质粒pBlueBacHis2A-VP1(633bp)。将pBlueBacHis2A-VP1(633 bp)质粒与Bac-N-BlueTMDNA共转染sf9昆虫细胞,蚀斑筛选重组病毒后,将纯化的重组病毒感染sf9细胞,获得了32.6 ku的目的蛋白条带。Dot-ELISA分析结果表明,该表达产物具有反应活性,可用于建立间接ELISA方法,进行口蹄疫病毒抗体检测。     

维氏气单胞菌脂蛋白的原核表达及其抗血清的抗菌作用研究

为了探究维氏气单胞菌毒力因子脂蛋白的生物学功能,对脂蛋白基因进行原核表达,对表达产物进行鉴定并制备多克隆抗体研究其抗菌效应。通过PCR扩增脂蛋白基因,连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒pET-32a(+)-Lpp。将重组质粒pET-32a(+)-Lpp转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达。利用His标签镍离子蛋白纯化柱对表达产物进行纯化,并采用SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白的表达产物。用纯化后的重组脂蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,多抗经皮下接种小鼠研究其抗菌效应。结果显示,经酶切鉴定和序列测定发现重组质粒pET-32a(+)-Lpp构建成功。通过SDS-PAGE检测发现,重组蛋白LPP在原核表达系统中以可溶性形式表达,分子质量约为69 ku。Western-blot结果显示,纯化后的重组蛋白LPP为单一条带。制备的多克隆抗体的效价为102 400,该多抗可提高荷菌小鼠的生存率,减少脾荷菌量。因此,本实验成功构建了重组质粒pET-32a(+)-Lpp,表达并纯化了重组蛋白LPP,制备的多抗具有抗菌作用,为该蛋白生物学功能的研究及疫苗的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3''端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

微小隐孢子虫类钙调蛋白基因真核表达质粒的构建及在Hela细胞中的表达

为了构建微小隐孢子虫类钙调蛋白(calmodulin-like protein,CML)基因的真核表达质粒,并在Hela细胞中实现表达,以微小隐孢子虫卵囊cDNA为模板,通过PCR扩增CML基因,插入到克隆载体pMD18-T中。对经鉴定的pMD-CML重组质粒进行双酶切,将目的基因连接到经同样内切酶双酶切的真核表达载体pVAX1上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用FuGENE HD转染试剂介导的方法,将重组表达质粒转染Hela细胞,用Western-blot技术和间接免疫荧光法检测外源基因的表达。结果显示,成功构建了微小隐孢子虫CML基因的真核表达质粒pVAX-CML,重组质粒在Hela细胞中实现了表达,表达产物具有良好的反应原性,为研究CML的特性和功能、寻找新的防控技术奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒OA58株3C基因的克隆与真核表达

利用RT-PCR技术扩增获得了长度约640 bp的口蹄疫病毒目的基因,回收片段后与pMD18-T载体进行连接,测序结果表明获得了口蹄疫病毒3C基因。将重组质粒pMD18-3C与表达载体pEGFP-N1分别用BamHⅠ+XhoⅠ双酶切后,进行定向亚克隆,对重组表达质粒pEGFP-3C进行PCR、酶切鉴定及DNA测序,结果表明重组表达质粒所含的3C基因读码框正确。用pEGFP-3C转染BHK-21细胞,荧光显示目的基因EGFP发出绿色荧光;对3C转录的mRNA进行RT-PCR鉴定,证实3C基因在BHK-21细胞中得到了表达。     

传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。