联合表达PPV VP2和PCV2 ORF2基因的重组PRV的构建

将包含有完整阅读框架的PPV VP2基因(1 740 bp)和PCV2 ORF2基因(750 bp)插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.采用脂质体介导法将重组质粒的DNA和PRV SA215株的DNA共转染Vero细胞,转染后20 h出现带荧光的空斑,挑斑纯化后繁殖,并收获病毒液.PCR和免疫荧光试验结果证实,成功构建了重组病毒,将其命名为PRV SA215(D1)株.细胞培养特性试验结果显示,重组病毒可以在Vero、MDBK、ST和IBRS-2等多种细胞上增殖,在Vero细胞上的增殖效价为1×106PFU.分别以1×106PFU/头、1×104PFU/头剂量接种28日龄仔猪,结果显示,免疫仔猪的PPV、PCV2抗体水平均逐渐升高,并分别从接种后第14 d和21 d开始,PPV、PCV2抗体转为阳性.此结果进一步佐证了重组PRV SA215(D1)株已构建成功.     

应用RT-nested PCR检测猪流行性腹泻病毒的研究

将猪流行性腹泻病毒分离株HLJ0 2 ,经过胰酶处理后 ,在Vero细胞上增殖。利用Gen Bank中的基因序列设计合成了 2对M基因引物 ,应用RT PCR和RT nestedPCR分别扩增出HLJ0 2的 85 4bp的M全基因片段和 41 2bp的M基因部分片段 ,而在猪传染性胃肠炎病毒中和Vero培养液中未扩增出上述产物。结果表明 ,RT nestedPCR可用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)。     

犬瘟热病毒昆明分离株的生物学特性

从1只曾接种过犬瘟热弱毒疫苗但又发病的宠物犬血样中分离到1株犬瘟热病毒(CDV),命名为CDV昆明分离株(CDV-KM)。该毒株可使Vero细胞产生以细胞融合及空泡化为特征的细胞病变,病毒效价为105.8TCID50/mL或1.76×106PFU/mL,并能在鸡胚绒毛尿囊膜、鸡胚成纤维细胞及MDCK细胞上增殖。微量中和试验结果发现,自制的犬抗CDV-KM株同份血清对CDV-KM株与参考毒株CDV-Onder-stepoort的中和抗体效价即半数保护量分别为1:142和1:132,显示二者未存在明显的中和表位差异。RT-PCR、RFLP和DNA测序分析结果显示,使用参照组合引物CDV-P2/P3/P4扩增,均可得到被认为指示弱毒株特征的177bp核酸片段;而H蛋白全长基因扩增产物未见能指示野生毒株特征的NdeⅠ和SspⅠ酶切位点;H蛋白基因与Onderstepoort小空斑变异株、鸡胚适应株和大空斑变异株的核酸序列同源性分别为98.84%、98.90%和100%。表明该分离株属于疫苗基因群。     

慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用

将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。     

伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)Fa株为对照,时PRV Fa株TK基因缺失株、PRV Fa株gI/gE双基因缺失株和PRV Fa株TK/gI/gE三基因缺失株进行了细胞培养特性的观察.包括对照毒株在内的4个毒株均按0.5 mL(1×10~6PFU)接种量分别感染IBRS-2、Marc-145、ST、Vero和MDBK等细胞系;选择在接种后第0、8、12、24、36和48 h观察感染细胞的形态学变化.结果显示,这4个毒株在这5种细胞上均能增殖并引起细胞病变,但PRV基因缺失株引起的病变程度均不及Fa株.表明,PRV的不同毒力基因对其致细胞病变能力不同.     

稳定表达人TMPRSS2基因BHK细胞系的建立及其对新城疫弱毒增殖效率评价

为提高细胞培养系统中新城疫病毒的增殖效率,通过构建TMPRSS2过表达的BHK细胞系,探索其对新城疫弱毒增殖的影响。本研究将TMPRSS2基因克隆于噬菌体载体pHAGE中,构建重组质粒pHAGE-TMPRSS2。将重组质粒pHAGE-TMPRSS2以及辅助包装质粒psPAX2和pMD2G共转染至293T细胞并收集上清。将包装好的慢病毒感染BHK细胞,通过Blasticidin加入筛选和有限稀释法将单克隆细胞扩大培养。经RT-PCR和Western-blot鉴定,结果表明,TMPRSS2在BHK细胞中获得了稳定的高表达。接种新城疫弱毒后通过TCID50测定显示,TMPRSS2过表达BHK细胞系能支持较高水平的病毒增殖。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

伪狂犬病病毒HNX株增殖特性及其致病性的研究

将伪狂犬病病毒(PRV)HNX株和经典Ea株分别接种PK-15和Vero细胞,观察细胞病变情况,用TCID50法检测HNX株的病毒效价并绘制一步生长曲线。将15头50日龄的PRV阴性仔猪随机平均分为3组,其中2组分别滴鼻接种1mL 107 TCID50的HNX株和Ea株病毒,第3组滴鼻接种1mL DMEM培养液作为空白对照。结果显示,HNX株和Ea株在这2种细胞中产生的CPE差异明显。病毒一步生长曲线显示,HNX株早期增殖速度明显比Ea株快。动物试验结果显示,接种HNX株的试验猪临床症状典型,体温和排毒量明显高于Ea株组,HNX株的致死率为60%(3/5),Ea株的致死率为0。HNX株造成的病理损伤比Ea株严重。结果表明,HNX株能快速适应宿主细胞,相关增殖特性发生明显改变,并且对仔猪的致病性明显增强。     

猪流行性腹泻病毒Vero细胞微载体培养条件的优化试验

通过研究搅拌速度、pH值、血清浓度等环境条件对细胞贴壁的影响以及细胞接种密度、微载体浓度与细胞生长的关系 ,对应用微载体技术和生物反应器系统生产猪流行性腹泻病毒(PEDV )的可行性进行了探讨。结果表明 ,搅拌转速、pH值、血清浓度均对Vero(PEDV )细胞在CT 3微载体上的贴壁率和均匀分布有影响 ;当接种密度为 15 .0× 10 4 /mL时 ,即每 1mg微载体接种 5 .0× 10 4 细胞时 ,可以获得较高的细胞密度 ;随着微载体浓度的提高 ,最高细胞密度也增加 ;在CelliGen反应器中 ,采用优化的培养条件 ,细胞密度可达到 174 .0× 10 4 /mL ,是方瓶培养的 3.5倍 ,每个细胞的PEDV含量与方瓶培养相当 ,制备的疫苗免疫原性好     

低血清培养PK-15细胞系对TGEV增殖规律的研究

为降低疫苗生产综合成本,本研究探讨了以低血清培养基(M08011)替代常规细胞培养基(DMEM)的可行性。本研究依次采用含100、80、50、30、20、10、0mL/L血清的低血清培养基(M08011)驯化PK-15细胞,并考察猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在低血清培养的PK-15细胞系中的增殖规律。结果显示,驯化后的PK-15细胞在含100、80、50、30、20 mL/L的低血清培养基中生长状态良好,与常规培养基所培养的PK-15细胞无差异。低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20 mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种TGEV后,TGEV的TCID50为10^-4.97/100μL,与常规条件培养的TGEV的TCID50为104.88/100μL相比,差别不明显。TGEV接种PK-15细胞,低血清培养基中血清浓度降低至20 mL/L,毒价未受到影响。结果表明,本研究建立的PK-15细胞及TGEV低血清培养体系可初步应用于TGEV的增殖培养,为相关疫苗研发奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒流行毒株的分离与鉴定

2016年3月江苏某猪场发生了哺乳仔猪腹泻疫情,导致大部分哺乳仔猪严重腹泻和死亡。为确定此次腹泻的病原,从该猪场采集了6份仔猪腹泻样品,利用RT-PCR方法对可引起仔猪腹泻的猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)三种主要腹泻病毒进行了检测。结果显示,6份样品均呈现PEDV阳性,而TGEV和PoRV为阴性。无菌处理6份阳性样品后分别接种于Vero细胞,进行病毒分离培养;结果,6份样品中仅JSqd3/2016接种后可产生明显细胞病变,且连续传至第5代时细胞病变仍稳定存在。对JSqd3/2016分离株利用针对PEDV S蛋白的特异单抗进行间接免疫荧光鉴定结果显示,PEDV S蛋白单抗能够特异性识别JSqd3/2016分离株感染的Vero细胞。对JSqd3/2016-F5分离株S基因和ORF3基因进行克隆测序和序列比较分析结果显示,分离获得的JSqd3/2016毒株与目前的流行毒株亲缘关系较近,与经典毒株相比S基因存在较大变异,氨基酸同源性为93.0%~93.3%。本研究结果证实,PEDV变异毒株感染是该猪场仔猪腹泻疫情的主要病因。     

猪伪狂犬病病毒S1株的分离与鉴定

从上海某猪场发病仔猪体内分离到 1株病毒 ,该毒株能在鸡胚成纤维细胞、RK、Vero、BHK2 1、ST、PK15细胞上增殖并产生细胞病变。通过蚀斑克隆对其进行纯化 ,克隆毒株在BHK2 1细胞上的TCID50 为 5 0 μL 10 -6.68稀释液。该病毒能被伪狂犬病毒 (PRV )阳性血清中和。接种细胞经PRV荧光抗体染色呈阳性反应。电镜观察可见直径 110～ 180nm的典型疱疹病毒粒子。用该病毒接种兔和仔猪均出现典型的伪狂犬病症状。表明该分离毒株为PRV。     

利用杆状病毒表达系统表达猪IFN-L3及其抗PEDV活性的研究

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在昆虫细胞上表达重组猪干扰素L3(rPoIFN-L3)进行抗猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究。首先通过间接免疫荧光和Western-blot验证rPoIFN-L3表达,并用Protein A亲和层析柱进行蛋白纯化;采用表达绿色荧光蛋白的水疱性口炎病毒(VSV~*GFP)检测rPoIFN-L3的抗病毒活性,含rPoIFN-L3的细胞上清的抗病毒活性为1×10~3AU/mL,纯化的rPoIFN-L3抗病毒活性为5×10~5AU/mg。进一步对纯化的rPoIFN-L3蛋白在IPEC-J2细胞上进行抗PEDV活性探究,结果显示,rPoIFN-L3可呈剂量依赖性抑制PEDV复制,并且上调相关干扰素-刺激基因(ISGs)的表达。由此证明,本研究表达的rPoIFN-L3具有抗病毒活性,并可有效抑制PEDV在IPEC-J2上的复制,对预防和治疗PEDV感染有重要意义。     

一株猪源1型呼肠孤病毒的分离及鉴定

为了研究猪呼肠孤病毒的分子生物学特性,通过在细胞培养液中添加胰酶的方法,从仔猪腹泻粪样中分离、纯化并鉴定了1株能在Vero细胞上稳定产生细胞病变,以细胞颗粒增多、肿胀、漂落等细胞病变为主要特征的猪源1型呼肠孤病毒SHR-A株。根据呼肠孤病毒的理化特性,对病毒进行初步纯化,然后进行电镜观察、核酸提取、RNA电泳、RT-PCR、各病毒基因扩增和克隆测序等常规病毒学鉴定。SHR-A株S1基因的同源性分析和核苷酸系统发育进化树分析表明,该病毒与哺乳动物呼肠孤病毒血清1型的同源性较高,而与血清2型和3型的同源性较低,因此初步判断该SHR-A株为血清1型,为国内首次报道从猪体内分离到血清1型的呼肠孤病毒。进一步分析发现,SHR-A的S1基因全长为1 465bp,其3′-UTR为3型,其余部分则为1型,说明其S1基因是1型和3型的嵌合体,此结果表明,哺乳动物呼肠孤病毒作为RNA病毒,基因重组可能是其除基因突变和基因重排以外的第3种病毒变异进化的重要方式。     

抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用

分别以猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪轮状病毒(Po RV)VP6基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因、猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Npro基因为靶基因,参照Gen Bank上登录的基因序列,利用DNAStar和Oligo7软件设计了4对引物。采用PCR分别扩增各病毒基因,并克隆至p MD18-T载体,获得4个阳性重组质粒。以重组质粒为模板,进行多重PCR方法的优化。特异性试验检测可分别扩增出相应的病毒基因片段;敏感性试验结果显示,检测PEDV、TGEV、Po RV及BVDV质粒的最低拷贝数分别为730copies/L、547 copies/L、6.47×103copies/L、705 copies/L。应用该方法对猪场44份猪腹泻样品进行检测,结果检出15份PEDV样品,3份TGEV样品,2份BVDV样品,其中PEDV与TGEV混合感染样品2份,TGEV与BVDV混合感染样品1份。随机抽取其中2份PEDV阳性样品进行病毒分离,病毒经细胞传3代以上PCR检测均为阳性,对PCR产物测序证实为PEDV。结果表明,本研究建立的多重PCR方法具有快速、简便、特异性强、敏感度高的特点,能够对PEDV、Po RV、TGEV和BVDV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

禽呼肠孤病毒S1133株在LMH细胞系中增殖特征的研究

为研究禽呼肠孤病毒(ARV)在鸡肝癌细胞(LMH)中的增殖特性,本研究将ARV S1133毒株感染LMH细胞,连续传代3次,观察细胞病变(CPE),通过RT-PCR鉴定病毒,并进一步研究病毒的增殖特性。结果显示,ARV S1133毒株能够在LMH细胞中很好地增殖,并出现典型的CPE。一步生长曲线结果显示,S1133感染LMH细胞后的前12 h为潜伏期,12 h~24 h为快速增长期,第24小时的效价达到最大,TCID50为10-9.2/0.1 m L。本研究为进一步研究ARV的致病机理和研制细胞灭活疫苗提供了良好的操作平台。     

适合猪圆环病毒2型敏感复制的PK15细胞株的克隆与鉴定

为了有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)在PK15细胞中增殖的效价,采用有限稀释法将PK15细胞进行克隆,通过间接免疫荧光方法筛选对PCV2敏感的克隆细胞.结果表明,通过克隆后获得1株对PCV2高度易感的细胞PK15-B1,该细胞接种PCV2后培养3 d,病毒的TCID50达10-7.0/mL,病毒效价和生产速度明显高于...     

PR8流感病毒突变株的制备及其在鸡胚上生长特性的研究

在前期发现流感病毒WSN株的NS2或NP蛋白突变使病毒在细胞上增殖能力明显提高的基础上,研究了这些突变是否会使PR8病毒效价在鸡胚上进一步提高的可行性,通过反向遗传操作技术获得了NS2E67S和NPP277A两株PR8突变病毒。经过比较突变病毒与野生病毒在鸡胚中的增殖能力,发现NS2E67S突变病毒在鸡胚上增殖后的效价与HA抗原表达量均明显提高,而NPP277A突变病毒在鸡胚上的增殖能力不及野生PR8病毒。该研究结果将对进一步研究病毒基因变异与宿主互作机制奠定基础,有可能通过NS2E67S突变病毒对改良流感疫苗具有重要的应用价值。     

马齿苋多糖对猪流行性腹泻病毒抑制作用的研究

提取马齿苋多糖(POP),研究它对猪流行性腹泻病毒(PEDV)体外复制的作用及机制。采用醇沉法提取POP并用纯化,选用VH细胞为模型细胞,检测纯化后的多糖对该细胞的细胞毒性。用PEDV感染VH细胞,建立体外病毒感染模型,用CCK-8和RT-q PCR的方法检测POP对细胞的保护和对病毒的抑制效果以及作用于病毒感染的时期,免疫荧光观察其对病毒复制的作用,并通过ELISA方法检测POP对体外PEDV感染模型分泌IFN-α、TNF-α、IL-6等细胞因子的影响。结果显示,POP浓度在0～25 μg/m L范围内对VH细胞无毒副作用;浓度为6.25～25 μg/m L时对PEDV具有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖性,免疫荧光可以清晰观察到其对病毒复制的抑制作用。该药物主要作用于病毒感染的吸附期;其对PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α和IL-6的分泌的抑制作用显著(P0.01)。由此得出:POP对PEDV感染的VH细胞具有明显的抑制作用,能抑制PEDV感染引起的细胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6的蛋白含量的增加,从而发挥抗病毒的作用。