猪IFN-α1重组蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其生物学特性

应用杂交瘤细胞技术,将用猪IFN-α1重组蛋白免疫的小鼠脾细胞经与骨髓瘤细胞融合、筛选和多次克隆化培养,成功获得了3株能稳定分泌抗猪IFN-α1的单克隆杂交瘤细胞株,分别将其命名为4E9、5B2和5H11。这3株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体经ELISA检测,体外细胞培养上清的效价均可达到1∶104,体内腹水的效价均可达1∶105;SDS-PAGE分析显示,纯化的这3株单克隆抗体的重链分子质量均在60ku以上,轻链均在30ku以上,符合抗体IgG重链、轻链分子的大小;抗体亚类鉴定表明4E9、5B2为IgG2a类,5H11株为IgG2b类,且其抗原结合位点基本一致。细胞染色体分析表明,3株杂交瘤细胞株染色体平均数为88～96条,远高于骨髓瘤细胞或脾细胞的染色体数,从遗传角度证实获得了杂交瘤细胞株;在杂交瘤细胞的稳定性试验中,这3株细胞经多次冻存复苏和传代培养,不同代次细胞上清中的抗体效价均在1∶104～1∶105之间,说明该3株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体的性能稳定。     

伪狂犬病病毒UL36蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

伪狂犬病病毒UL36基因编码的皮层蛋白VP1/2在病毒粒子组装过程中发挥重要作用。本试验以UL36基因为研究对象,将截短的UL36基因克隆入载体pCold I,构建了重组原核表达质粒pCold I-UL36。经诱导表达,将包涵体形式表达的重组蛋白经过变性、亲和层析及复性后获得了纯度较高的蛋白。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合和间接ELISA方法筛选出1株能稳定分泌针对UL36蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,被命名为UL36-6,抗体亚型鉴定结果为Ig G1和κ,制备的腹水抗体中和效价及纯度高,Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明单克隆抗体具有很好的特异性。综上所述,本研究成功制备出1株针对PRV UL36蛋白的单克隆抗体,为深入研究UL36蛋白的生物学功能奠定了基础。     

衣原体单克隆抗体在牛羊血清诊断上的应用

采用淋巴细胞杂交瘤技术,研制出的抗衣原体单克隆抗体,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,对本地区所采集的128份羊血清、90份牛血清进行检测.结果,羊血清阳性检出率为25.8%,牛血清阳性检出率为32.2%.选择50份羊血清、50份牛血清用已建立的检测衣原体抗体ELISA与间接血凝试验(IHA)进行比较,牛血清ELISA阳性检出率为32.0%,IHA为24.0%,ELISA比IHA试验高出8个百分点;羊血清ELISA阳性栓出率为26.0%,IHA为22.0%,ELISA比IHA高出4个百分点.     

ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP重组蛋白的表达及广谱性NDV单克隆抗体的制备

为了制备针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,采用RT-PCR方法从ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株中扩增出NP基因,并定向克隆至pET-32a-c(+)原核表达载体中,经酶切鉴定及测序验证后转化BL21(DE3)进行原核表达,用纯化得到的NP重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠。结果显示,成功表达出分子质量约为71ku的NP重组融合蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的蛋白以可溶性形式存在于菌体中。用间接ELISA方法成功筛选出2株针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,该抗体具有良好的ELISA、IFA以及Western-blot效价。免疫特异性鉴定结果表明,获得的2株单克隆抗体具有良好的通用性,无论是ClassⅠ毒株还是两种不同基因组长度的ClassⅡ毒株,均能与其发生特异反应。     

猪细小病毒1型VP2蛋白的表达与单克隆抗体的制备及应用

为研制抗猪细小病毒1型(PPV1)VP2蛋白的单克隆抗体,用重组杆状病毒表达的PPV1VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,融合后采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验筛选抗PPV1VP2的单克隆抗体阳性细胞株,并对单克隆抗体的腹水效价、免疫反应特性及亚类进行了系统鉴定。结果显示,共获得8株阳性杂交瘤细胞株,其腹水抗体效价均达1∶51 200,其中7株的重链亚类为IgG1,另1株(4A1)为IgM;6株的轻链为κ型,另2株(8D7和4A1)为λ型。这些单克隆抗体均可与PPV1感染的猪睾丸细胞呈阳性反应;Western-blot结果显示,这些单克隆抗体可与自然PPV1VP2蛋白产生良好的免疫反应。以其中1株单克隆抗体(8E4)建立了间接ELISA,通过对重组杆状病毒表达的PPV1VP2蛋白产物进行的动力学检测表明,第72小时蛋白表达量最高;对PPV1感染细胞增殖规律的测定结果显示,接种后第16小时可检测到病毒感染的阳性细胞,说明该病毒复制周期小于24h。本研究获得的单克隆抗体可用于重组VP2蛋白抗原的检测及病毒繁殖规律的研究。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。     

家兔γ干扰素基因的原核表达及其表达产物的单克隆抗体的制备

将PCR扩增的家兔γ干扰素基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体上,构建重组载体pET-28a(+)-IFN-γ。重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、HisTrap亲和柱纯化,获得IFN-γ重组蛋白。以IFN-γ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术获得4株抗IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3H8、4G4、4F10、6C12,它们的亚型分别为IgG1、κ链,IgG2b、κ链,IgG1、κ链,IgG1、κ链。分别制备单克隆抗体腹水,结果,4株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-4~10-5之间。本试验通过制备抗家兔IFN-γ单克隆抗体,为研究和检测IFN-γ提供了一种重要的工具。     

传染性支气管炎病毒非结构蛋白nsp10单克隆抗体的制备

为了体外获得大量表达的传染性支气管炎病毒(IBV)的非结构蛋白10(nsp10)并制备其单克隆抗体,通过RT-PCR扩增获得了IBV nsp10基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)中。重组载体pET-28a(+)-nsp10转化的表达宿主菌在1mmol/L IPTG诱导5h获得高效表达。用纯化的重组蛋白Hisnsp10免疫小鼠制备单克隆抗体,采用有限稀释法经过3轮筛选和鉴定最终获得了2株分泌抗nsp10单克隆抗体的细胞株1G2和3G7。2株单克隆抗体在Western-blot分析中均与重组His-nsp10蛋白反应,并通过间接免疫荧光试验识别了4种不同毒株感染的DF-1细胞。IBV nsp10单克隆抗体的成功制备为IBV的检测和nsp10蛋白功能的研究奠定了基础。     

隐孢子虫病抗体治疗的研究进展

从超免疫初乳、超免疫血清、超免疫卵黄和单克隆抗体几个方面概述了国内外隐孢子虫病抗体治疗的研究现状,并介绍了预防隐孢子虫病疫苗的研究成果,为进一步防治该病提供了参考.     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用RT-PCR扩增了猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗株(C株)的E2蛋白主要抗原区(tE2)编码区,并定向克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组表达载体pPROEX-tE2,将其转化大肠杆菌DH5α菌株,经IPTG诱导,tE2蛋白获得高效表达;经检测,该重组蛋白能被CSFV C株抗血清识别.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了1株稳定分泌抗tE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株.经检测,该单克隆抗体能够与CSFV C株和石门株以及杆状病毒表达的重组E2蛋白发生特异性反应.推测,该单克隆抗体是针对CSFV E2蛋白的一个保守线性表位.