猪IFN-γ mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测猪γ-干扰素(IFN-γ)的荧光定量RT-PCR方法,针对猪IFN-γ基因和管家基因cyclophilin A(CyPA)的核苷酸序列分别设计了特异性引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-IFN-γ和pMD18-T-CyPA为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建猪IFN一γ mRNA和CyPA的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果表明,建立的方法在1×101～1×107copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数r2均高达0.999,扩增效率均高于99.0%;可检测至少为100 copies的阳性标准品.该方法具有快速、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可应用于临床样品的检测.     

重庆地区部分牛和猪外周血博尔纳病病毒自然感染的调查

采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应检测了重庆地区牛和猪各50例外周血单核细胞中博尔纳痛病毒(Borna disease virus,BDV)p24基因片段,并对其进行BDV p40基因片段的检测以确保结果的可靠性.检出的阳性序列与GenBank中5个国家4个动物种属25例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列的同源性,重建基因系统发生树.结果显示,3例牛和2例猪血标本BDV p24检测呈阳性,阳性率分别为6.00%和4.00%;5例标本BDV p40片段检测均为阳性,其余标本均为阴性;BDVp24扩增产物序列与BDV标准病毒株He/80的同源性为100%,与H1766和Strain V相比,变异程度小,所编码的氨基酸序列亦无变化;从发生树可以看出,5例BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-重庆混合支系.提示,重庆地区牛和猪中可能存在BDV的自然感染,其流行株可能源于外来疫病病原的传入.     

耐环丙沙星沙门菌marA、soxS和ramA基因以及外排泵基因acrA和acrB的表达水平分析

应用实时荧光定量PCR法对11株鸡源环丙沙星诱导耐药沙门菌和11株人源临床环丙沙星耐药沙门菌的调控基因marA、soxS、ramA和外排泵基因acrA、acrB的mRNA表达水平进行了检测和分析.结果表明,11株诱导株与诱导母株相比,marA、soxS、acrA和acrB的mRNA表达量均显著增加(P＜0.05),ramA表达量未增加;11株人源临床耐药株与标准菌株相比,marA、acrA和acrB的表达量显著增加(P＜0.05),soxS和ramA的表达量未增加.提示,鸡源诱导株AcrAB过表达与marA和soxS过表达相关;人源临床株AcrAB过表达与marA过表达相关,而与soxS和ramA表达不相关.     

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株.用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗.选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法.用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性.用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%.该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具.     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛副流感病毒3型的双重荧光PCR方法的建立及应用

为建立同时检测牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）和牛副流感病毒3型（BPIV3）的方法,通过对引物和探针筛选、反应体系和条件优化,成功建立了检测IBRV和BPIV3的双重荧光定量PCR方法。该方法只能特异性地检出IBRV和BPIV3,而对其他无关病原均不能检出;批内和批间变异系数均小于3%;对IBRV和BPIV3质粒标准品的检测下限分别为15.2 copies/μL和18.3 copies/μL。用建立的方法对采自四川、重庆、河北、安徽和吉林这5个地区的143份肉牛呼吸道疾病综合征(BRDC)样本以及四川省和青海省的59份牦牛BRDC样本进行检测,结果显示,肉牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为42.66%和39.86%,混感率为22.38%;牦牛样本中IBRV和BPIV3的阳性率分别为44.07%和30.51%,混感率为18.64%。上述结果表明,本研究建立的双重荧光定量PCR方法具有特异性和稳定性好、灵敏度高的特点,适用于临床上对IBRV和BPIV3的快速检测,临床样本的检测结果丰富了国内IBRV和BPIV3的流行病学资料。     

猪乳头瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可以快速检测猪乳头瘤病毒(SsPV)的方法,根据SsPV E2基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增SsPV E2保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-SsPV作为标准品质粒,经实时荧光定量PCR(qPCR)条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的qPCR方法在7.2×10¹～7.2×10⁸ copies/μL模板浓度区间内与Ct值呈现良好的线性关系,检测下限为7.2×10⁰copies/μL,灵敏度比普通PCR高100倍;与猪德尔塔冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪捷申病病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒4型无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.0%;对44份猪皮肤组织样品进行检测,检测阳性率为2.27%,普通PCR检测阳性率为0%。综上所述,本试验成功建立了SsPV qPCR检测方法,为SsPV的快速检测提供了可靠方法。     

综合现场痕迹物证分析刻画杀人凶犯

2004年3月14日凌晨3点左右,居住在某县供销社家属院的李某收摊回家休息途中行至刘某(女,42岁)家院墙时,听见从刘家传出呼救声,遂唤人将刘家街门踹开,发现其家堂屋地面上有大量血迹,刘某已死亡,其女儿夏某、母亲常某被刺伤。李某马上拨打120,同时报警。发案现场位于县供销社家属院自南向北第四排西第一户刘某家中。刘家街门朝西,为双扇铁门,南门扇串钉鼻断裂;有堂屋楼房七间(其中楼下四间,楼上三间);东屋三间为平房(连过道),与堂屋相连,平房屋顶与楼上走廊相连。刘某与其母常某合住一间,女儿夏某自住,均居楼下堂屋,分别与客厅相通。楼下东侧…     

人体液斑迹与非生物斑迹鉴别的三维荧光光谱分析

目的 利用三维荧光光谱分析技术,建立一种人体液斑迹与非生物斑迹的快速无损鉴别方法。方法 通过对采集的人唾液、3%的血液、咖啡、芬达斑迹的三维荧光光谱数据进行降维处理,经过小波变换、光谱去噪、特征提取后建立分类公式,使用Fisher判别法进行光谱匹配识别,建立区别斑迹类型的分析方法。结果 根据数据训练和比对结果,芬达、咖啡、唾液和血液均能达到91.39%以上的识别准确率,其中唾液达到了100%的识别准确率。结论 三维荧光光谱分析是一种有潜力可实现快速无损鉴别生物斑迹与非生物斑迹的方法。     

参芪健心方治疗射血分数中间值心力衰竭患者临床观察

目的 观察参芪健心方治疗射血分数中间值心力衰竭（heart failure with mid range ejection fraction，HFmrEF）的临床疗效。方法 将60例HFmrEF患者按随机数字表法平均分为两组，观察组30例患者在西医基础治疗的同时，给予参芪健心方治疗，每日1剂；对照组30例患者仅接受西医基础治疗；疗程均为4周。比较两组患者治疗前后脑钠肽（B type natriuretic peptid，BNP）、左心室舒张末内径（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、6分钟步行距离（6 minutes walking distance，6MWD）、中医证候积分，基于纽约心脏病协会（New York Heart Association，NYHA）心功能分级的临床疗效及主要心血管不良事件（major adverse cardiovascular events，MACE）发生情况。结果 与治疗前比较，两组患者治疗后BNP均显著下降（P＜0.05），LVEF、6MWD均显著提升（P＜0.05）；观察组BNP下降幅度和LVEF、6MWD提升幅度均大于对照组（P＜0.05）。与治疗前比较，两组患者各项证候积分治疗后均显著下降（P＜0.05），且观察组患者治疗后喘息和（或）气短、心悸、乏力、倦怠少言、自汗、语声低下评分下降程度显著大于对照组（P＜0.05）。观察组疗效优于对照组（P＜0.05）。两组治疗周期内均未出现严重不良反应及MACE。结论 参芪健心方通过纠正心力衰竭气虚血瘀证患者的病理状态，在改善临床症状、提升心功能方面，显示出良好的临床获益。     

清肾颗粒对单侧输尿管梗阻致肾间质纤维化大鼠肾组织Wnt/β- catenin信号通路的干预作用

目的 基于Wnt/β- 连环蛋白（β- catenin）信号转导通路探讨清肾颗粒抗肾间质纤维化的作用机制。方法 将38只SD大鼠随机分为清肾颗粒组、贝那普利组、模型组和假手术组。采用单侧输尿管梗阻法复制肾间质纤维化模型。模型复制成功后，清肾颗粒组和贝那普利组大鼠分别给予清肾颗粒、贝那普利灌胃，假手术组和模型组给予等容积温水灌胃，疗程均为4周。检测24 h尿蛋白定量、血清肌酐、尿素氮水平以及肾脏组织中Wnt1、β- catenin和E- 钙黏蛋白（E- cadherin）含量。结果 模型组大鼠24 h尿蛋白定量、血尿素氮、血清肌酐、Wnt1、β- catenin水平均高于假手术组（P＜0.05），E- cadherin水平低于假手术组（P＜0.05）；与模型组比较，清肾颗粒组和贝那普利组24 h尿蛋白定量、血尿素氮、血清肌酐、Wnt1、β- catenin水平明显降低（P＜0.05），E- cadherin水平明显升高（P＜0.05），清肾颗粒组上述指标的改善显著优于贝那普利组（P＜0.05）。结论 清肾颗粒改善肾间质纤维化的机制与抑制Wnt/β- catenin信号通路有关。