H3N2亚型猪流感病毒核蛋白基因的优化表达及抗原性分析

根据已获得的猪流感病毒(SIV)分离株A/Swine/Guangdong/9/05(H3N2)NP基因的核苷酸序列设计合成了1对带有特定酶切位点的引物,经RT-PCR扩增NP基因,将其克隆到pMD19-Simple-T载体,鉴定并测序正确后,构建pET32a-NP表达质粒,并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为73ku,在25℃条件下主要以可溶性形式存在。将重组NP蛋白纯化后进行Western-blotting和间接免疫荧光试验,结果显示,表达蛋白可分别与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有良好的反应原性和交叉反应性;用纯化的重组NP蛋白免疫小鼠制备的多克隆血清也可与H1N1、H3N2及H9N2亚型SIV发生特异性反应,进一步证实所表达的重组NP蛋白具有良好的免疫原性。     

八株芽孢杆菌的分离鉴定及其抗逆性比较

从土壤中分离到3个菌株,分别命名为KF、DY和LB1,从猪粪便中分离到5个菌株,分别命名为KH、K2X、KY1、LB2和LY3,通过16SrRNA基因序列分析,结合细菌形态学、生理生化特性进行了鉴定,并对分离菌的抗逆性进行了比较。经鉴定,KF、KH、K2X和KY1菌株为枯草芽孢杆菌,LB1、LB2和LY3菌株为蜡样芽孢杆菌,DY菌株为地衣芽孢杆菌;抗逆性比较结果显示,K2X菌株对温度比较敏感,其他菌株经60℃处理30min后不影响其生长;DY菌株耐酸性最强,能在pH3的胃液中正常生长;KY1菌株的耐酸性次之,耐胆盐能力最强,能在胆盐含量为6g/L的培养基和模拟肠液中正常生长。研究还发现,这8个菌株对共培养的大肠杆菌都没有抑制作用,只有KF、KH和LB2菌株对共培养的沙门氏菌分别有28.6%、27.0%和24.6%的抑菌效果。     

异育银鲫致病性鲍曼不动杆菌的鉴定和系统发育分析

从濒死的异育银鲫肝中分离到1株革兰阴性菌(YCS07-04株),经人工注射感染,5×106CFU/mL剂量组异育银鲫表现较强的致病性,感染第14 d死亡率为100%.YCS07-04菌株的主要生化特性为氧化酶阴性,氧化型,接触酶阳性,无运动力,VP试验阳性,利用柠檬酸盐作碳源;在普通琼脂和麦康凯琼脂中生长良好,在SS琼脂培养基中不生长.经负染电镜观察,菌株为末端圆形的短杆状,偶尔可见不规则丝状体,大小(短径×长径)为1.0～1.5μm×1.5～2.5μm,无芽孢、荚膜和鞭毛,表面凹凸不平,静止期呈球形.16 S rRNA基因序列的测序结果为1 343 bp(登录号EU733247),与鲍曼不动杆菌的同源性为99.0%,系统发育分析结果与ATCC 19606T(登录号为Z93435)聚为一个分支,与鲍曼不动杆菌属同一类群.YCS07-04菌株经培养特征、形态、生理生化特性和系统发育分析等鉴定为鲍曼不动杆菌.     

鸭瘟病毒UL26.5基因的克隆和编码蛋白的亚细胞定位

对鸭瘟病毒(DPV)UL26.5基因(GenBank登录号EF643564)的分子特征分析表明,其具有疱疹病毒支架蛋白的典型特征,含有6个保守的结构功能域和1个丝氨酸蛋白酶水解位点(M位点),且具有与其功能相关的磷酸化位点;编码的多肽链是一种膜外蛋白.DPV UL26.5与α-亚科禽类疱疹病毒属的进化关系最近.将UL26.5基因扩增产物亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,并转化至E. coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,获得一约59 ku的表达蛋白,与预期大小一致.将重组蛋白纯化后,制备兔抗血清,经间接ELISA检测,效价达1:204 800.DPV UL26.5基因编码蛋白亚细胞定位检测结果显示,最早可在感染后10 h的细胞核中检测到该蛋白,12 h后细胞核中出现较多绿色荧光,48 h时细胞质中也出现少量荧光.试验结果为进一步开展DPV UL26.5基因功能的研究提供了重要数据和材料.     

重庆地区部分牛和猪外周血博尔纳病病毒自然感染的调查

采用荧光定量巢式实时逆转录聚合酶链反应检测了重庆地区牛和猪各50例外周血单核细胞中博尔纳痛病毒(Borna disease virus,BDV)p24基因片段,并对其进行BDV p40基因片段的检测以确保结果的可靠性.检出的阳性序列与GenBank中5个国家4个动物种属25例BDV p24基因序列进行比对,分析其核苷酸和氨基酸序列的同源性,重建基因系统发生树.结果显示,3例牛和2例猪血标本BDV p24检测呈阳性,阳性率分别为6.00%和4.00%;5例标本BDV p40片段检测均为阳性,其余标本均为阴性;BDVp24扩增产物序列与BDV标准病毒株He/80的同源性为100%,与H1766和Strain V相比,变异程度小,所编码的氨基酸序列亦无变化;从发生树可以看出,5例BDV p24片段序列汇聚德国-瑞士-奥地利-日本-重庆混合支系.提示,重庆地区牛和猪中可能存在BDV的自然感染,其流行株可能源于外来疫病病原的传入.     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒(NDV)F48E9株融合蛋白(F)基因1700 bp克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建成表达F基因的载体pc3F.然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800 bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒(HVT)非必须片段载体pTK2B中,构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒载体pTK3F.经限制性内切酶酶切分析,F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致.该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础.     

伪狂犬病病毒gG-gD基因片段的扩增及克隆和序列测定

以伪狂犬病病毒(PRV)HB-9304株的基因组为模板,利用聚合酶链反应(PCR)对其gG-gD基因片段进行扩增,获得了预定大小的片段,将这一片段克隆到质粒载体pPK中.对重组质粒pPKGD进行限制性内切酶分析、PCR鉴定和克隆片段的序列测定,证实了克隆片段的可靠性.     

旋毛虫FYVE锌指结构蛋白基因的克隆及表达

用旋毛虫新生幼虫差减cDNA文库中的T54克隆作为核酸探针,对旋毛虫成虫和新生幼虫混合cDNA文库进行筛选,获得1个全长1464 bp的cDNA分子.该cDNA含有1个1290 bp的开放阅读框架(ORF),Blastn同源性分析表明,与其它已知生物基因序列无明显的同源性,为一新的cDNA.该ORF编码1个429个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量理论推导值为49.9 ku,等电点为5.6,在12-14及103-105氨基酸残基处分别有2个糖基化位点NLS及NVS,在C末端344-409氨基酸残基处有1个FYVE锌指结构域(Profile PS50178).Blastp同源性分析表明,与广东管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)66.0 ku蛋白(gi/1743430)同源性最高,为39.0%.在此基础上对旋毛虫FYVE锌指结构重组蛋白进行了表达,表达蛋白占茵体蛋白的24%.     

骨骼肌circRNA在死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

目的通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circRNAs,并对筛选出的circRNAs进行验证,进而探讨其相对表达量与死亡时间的相关性。方法芯片实验选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h内的个体,分别于尸检即刻(12 h以内)、3、5、7、10 d各取50 g组织进行总RNA提取,并进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,初步得到circRNA表达谱;对筛选出的circRNAs在后续收集的18例检材中进行验证,对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,但在10 d内整体呈下降趋势的circRNAs只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019717个。对所筛选出的7个circRNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_00002845个circRNAs随着死亡时间增加,其相对表达量显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。而hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019712个circRNAs的表达为阴性。结论circRNA是一种较为稳定的生物标记物,部分可用于死亡时间推断的研究。     

Prescribing engagement in environmental risk assessment for gene drive technology

Gene drive technology is a nascent biotechnology with the potential to purposefully alter or eliminate a species. There have been broad calls for engagement to inform gene drive governance. Over the past seven years, the gene drive community has been developing risk assessment guidelines to determine what form future gene drive risk assessments take, including whether and how they involve engagement. To explore who is developing these guidelines and how engagement in risk assessment is being prescribed, we conduct a document analysis of gene drive risk assessment guideline documents from 2014 to 2020. We found that a narrow set of organizations have developed 10 key guideline documents and that with only one exception the documents prescribe a narrow, vague, or completely absent role for engagement in gene drive risk assessment. Without substantively prescribed engagement in guidelines, the relevance, rigor, and trustworthiness of gene drive risk assessment and governance will suffer.