副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用

将副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)血清型4、5型分离菌株经超声波破碎处理后的产物致敏醛化红细胞,建立了检测HPS抗体的间接血凝试验方法。最适反应条件为绵羊红细胞30℃醛化5 h,4、5型菌株浓缩抗原以1∶8稀释致敏红细胞。免疫猪2周后检出率达89%。对15种HPS血清型阳性血清进行检测,结果均为阳性;对猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪链球菌、猪肺疫巴氏杆菌、Ⅰ相支气管败血波氏杆菌及胸膜肺炎放线杆菌阳性血清进行检测,结果均为阴性。敏感性为琼脂扩散试验的16倍。对1 665份猪血清进行检测,阳性率为47.1%。结果表明,该方法敏感性较高,特异性强,重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及副猪嗜血杆菌的流行病学调查。     

抗人心肌肌凝蛋白重链单克隆抗体在心肌缺血尸检例中的应用

为了更有效地检测早期及超早期心肌缺血性病变，对5例心肌组织材料进行了肌凝蛋白重链（MyosinH链）及肌红蛋白的免疫组织学染色，探讨了肌凝蛋白的染色情况、抗原分布、死后变化对染色的影响及心肌早期、超早期缺血的有无、程度及与死亡的关系。应用石蜡组织切片进行的抗人心肌肌凝蛋白重链免疫组织学染色，在病理学方面尚属首次，这种单克隆抗体对人的特异性高，无共集现象，在心肌缺血数分钟乃至十几分钟后即可发现缺血心肌细胞中肌凝蛋白重键的脱失像，是分析早期、超早期心肌缺血所致急死及其它原因死亡案例心肌缺血病变的有力方法。     

分泌抗人红细胞膜单克隆抗体细胞株的建立

以人的红细胞膜为抗原，采用选择性免疫抑制的程序，免疫BALB／C小鼠。经免疫的小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用血凝法筛选出3株分泌抗人红细胞膜种属特异性单克隆抗体的杂交瘤，即M1A7C4．M3A5B7和M3D9F1。连续传代2个月及复苏冻存半年的杂交瘤，仍能稳定地分泌抗人红细胞膜单克隆抗体。初步鉴定证明：该抗体具有稳定的种属特异性，可鉴别人与其它动物，特别是猴的红细胞，不与己知的血型特异性成分交叉，可凝集成人及脐带血的红细胞。     

NF-κB受体激活因子配体的表达及其多克隆抗体的制备

为获取猪源NF-k B受体激活因子配体(RANKL)及其抗体,根据GenBank中猪源RANKL的序列设计引物,将合成的RANKL基因克隆至pMAL-C4x表达载体,转化到大肠杆菌DH5α。经PCR和双酶切鉴定后测序分析,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21后通过IPTG诱导表达。优化表达条件,确定是包涵体表达,蛋白大小为78.1 ku。使用纯化的RANKL为抗原免疫兔制备多克隆抗体。构建重组质粒pCMV-RANKL,表达目的蛋白并使其与多克隆血清反应。经ELISA、Western-blot和IFA鉴定,证实抗RANKL多克隆抗体有良好的抗原特异性,为后续黏膜免疫的研究奠定了基础。     

西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

跗关节免疫法抗镉单克隆抗体的制备

为快速方便地检测环境水样中的镉离子浓度,以Cd-ITCBE-KLH为免疫抗原,采用小鼠跗关节注射抗原法,分2次免疫BALB/c小鼠,每次注射20μg抗原,首次免疫后第20天收获皮下腘淋巴结,采用常规方法与骨髓瘤细胞融合,筛选细胞株,以体内诱生腹水法收获单克隆抗体,纯化后建立了镉离子的竞争ELISA检测方法。结果显示,共筛选了A2G11、A4B8B1C2、B1G5、B4F12五株杂交瘤细胞,采用其中的1株A2G11细胞株建立了镉离子的竞争ELISA检测方法,其工作曲线方程为y=-0.119 5lg[Cd2+]+0.615 4,r2=0.973 2;半数抑制浓度为1.485μg/L,检测范围(IC20～IC80)为0.029～762.676μg/L,最低检测限为0.102μg/L;与其他金属离子的交叉反应≤3.684%。表明用该方法能够有效制备抗金属离子的单克隆抗体。     

鹅IL-18基因的克隆和原核表达及其多克隆抗体的制备

参考GenBank中鸡、火鸡和鸭IL-18基因序列,设计了1对特异引物,以提取的鹅脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR扩增、克隆鹅IL-18基因中间的333bp序列。序列分析结果表明,其与鸭IL-18基因对应序列相似性最高,达99%。参考鸭IL-18全基因序列设计上、下游引物各3条,以梯度PCR探索扩增、克隆鹅IL-18全基因。以上述策略成功扩增、克隆了3个广东地方杂交品种鹅的IL-18基因。序列分析表明,这3个杂交品种鹅的IL-18基因序列一致,长642bp,含一个603bp的ORF,编码200个氨基酸,分子质量为23.2ku。ORFN端的30个氨基酸为前导序列,其余170个氨基酸为功能蛋白序列。在GenBank中注册了第一条鹅的IL-18基因序列,登录号为EF159728。随后,构建了鹅IL-18基因ORF的重组原核表达质粒pET-GIL-18,经诱导表达、纯化获得重组鹅IL-18融合蛋白,并以其制备了兔抗重组鹅IL-18多克隆抗体。     

马流感病毒NP单克隆抗体的制备及特性鉴定

利用原核表达的马流感病毒(EIV)核蛋白(NP)为免疫原,经腹腔接种4周龄BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经4次有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选,获得了3株稳定分泌单抗的杂交瘤细胞株2G11、3E10和4A1,并对它们进行了亚类鉴定、间接ELISA检测和特性鉴定。结果显示,单抗2G11为IgG1亚型,3E10为IgG2a亚型,4A1为IgM亚型,轻链均为κ链。单抗2G11、3E10和4A1的细胞上清液及腹水效价分别为1∶640、1∶640、1∶320和1∶409 600、1∶204 800、0。这3株单抗均能特异性识别EIV NP重组蛋白,并且能够与天然EIV结合;获得的3株单抗与马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马乙型脑炎病毒均不发生交叉反应。亲和力试验结果显示,单抗2G11和3E10与EIV的亲和力常数分别为4.39×106 M-1和2.20×106 M-1。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

同卵双生子甄别策略探讨

同卵双生子(MZ)之间存在抗体库差异、甲基化修饰差异和基因突变体差异,甲基化修饰差异的比较可望成为甄别MZ的手段之一,抗体库差异和基因突变体差异比较的方法在甄别MZ方面亦有潜在价值.当前,对MZ的表现遗传以及基因突变等领域的研究还很有限,而抗体库技术的应用方法也有待探讨,因此MZ识别技术的应用前景和发展空间需要进一步摸索与完善.