西尼罗病毒E蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

利用PCR技术扩增西尼罗病毒(WNV)E蛋白基因并将其插入原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-30a(+)-WNV-E,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的蛋白表达,对诱导条件进行优化,利用His镍柱亲和层析法纯化目的蛋白,纯化后的蛋白经SDS-PAGE与Westernblot鉴定正确后,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行间接免疫荧光鉴定。结果显示:WNV E蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式被成功表达,蛋白最佳诱导条件为37℃,0.8 mmol/L IPTG诱导5 h,经间接免疫荧光鉴定多克隆抗体能特异性识别WNV E蛋白。本研究成功表达并纯化了WNV E蛋白,证明该蛋白具有良好的免疫原性,为WNV抗原、抗体检测方法的建立和新型疫苗的研发及相关研究奠定了基础。     

猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。     

猪带绦虫缺氧诱导因子-1的原核表达和真核表达及其多克隆抗体的制备

为了表达猪带绦虫的缺氧诱导因子-1(HIF-1)并制备其特异性抗体,根据本课题组对猪带绦虫全基因组测序获得的HIF-1基因序列设计了1对特异性引物,以提取的猪带绦虫的总RNA为模板,通过RTPCR获得猪带绦虫HIF-1基因。将该基因定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,获得了约为17.0ku的表达产物,与目的蛋白的大小相符。原核表达的蛋白纯化后免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,ELISA和Western-blot结果表明,制备的多克隆抗体有较高的抗体效价(1∶51 200)和抗原特异性。该基因又被定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1中进行了真核表达。结果成功构建了猪带绦虫HIF-1因子的原核表达系统和真核表达系统,并制备出其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定了基础。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

临床分离动物源性大肠杆菌周浆蛋白AcrA表达水平的测定

为研究大肠杆菌周浆蛋白AcrA表达水平与不同动物源性大肠杆菌多重耐药水平之间的关系,将获得的重组阳性质粒pET28a(+)-acrA转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经IPTG诱导表达,得到约42ku的目的蛋白。AcrA蛋白表达产物经侧带法纯化后免疫獭兔,制备抗AcrA的多克隆抗体,采用间接ELISA法检测临床分离的31株不同动物源性大肠杆菌中acrA基因的表达水平。结果显示,随着多数被检大肠杆菌多重耐药水平的提高,AcrA蛋白的表达量有上调的趋势。表明,动物源性大肠杆菌的多重耐药水平与AcrA蛋白的表达水平可能存在相关性。     

猪源多聚免疫球蛋白受体的表达及抗血清的制备

为了制备猪源pIgR蛋白的多克隆抗体,分析NCBI提供的猪源pIgR的胞外区基因序列并设计引物,经过PCR、酶切、连接,将目的 序列克隆入原核表达载体pET-30a(+),测序验证成功后,将带有目的 片段的重组质粒转化入大肠杆菌(E.coli) BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,通过Ni-NTA亲和层...     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。     

大肠杆菌多重耐药调控基因rob的原核表达及其表达蛋白多克隆抗体的制备

提取阳性克隆质粒pMD18-T-rob,经SacⅠ+XhoⅠ双酶切,回收目的片段,定向克隆到pET-28a(+)原核表达载体中,提取阳性质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,SDS-PAGE分析证实pET-28a-rob可成功地在大肠杆菌中表达出Rob蛋白。Western-blot分析证明,Rob蛋白具有良好的反应原性。表达出的Rob蛋白经侧带法纯化后免疫獭兔3次,制备抗Rob蛋白的多克隆抗体。通过间接ELISA方法检测抗体效价,结果表明抗体血清1∶40稀释时抗体效价较高。     

猪白细胞介素21基因的原核表达与多抗血清的制备

为了制备猪白细胞介素21(porcine interleukin-21,pIL-21)的多克隆抗体,采用RT-PCR从猪外周血单个核细胞(PBMC)扩增获得pIL-21基因,然后将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)之中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,pIL-21以可溶性蛋白形式表达,分子质量为35ku,具有良好的反应原性。经过Ni-NTA镍离子亲和层析纯化,获得纯化的重组蛋白pIL-21。用其免疫BALB/c小鼠制备抗pIL-21血清抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体可与杆状病毒表达的重组Cap-pIL-21、ConA和PHA共刺激的猪PBMC细胞发生特异性反应,ELISA抗体效价可达1∶12 800。上述研究结果为pIL-21的生物学功能研究奠定了重要基础。     

猪乳转铁蛋白N端活性区的表达和多克隆抗体的制备

在采用亲和层析技术筛选猪嗜血霉形体表面黏附蛋白MSG1相关受体的过程中,发现猪乳转铁蛋白(LTF)可能是MSG1蛋白的潜在受体。为了对其受体功能进行确认,对截短的猪乳转铁蛋白进行了原核表达和多克隆抗体的制备。首先,以人工合成的猪乳转铁蛋白全基因为模板,通过PCR扩增猪乳转铁蛋白基因N端762个碱基后连接入pET-32a(+)载体中。其次,将重组质粒导入大肠杆菌BL-21感受态细胞中用IPTG进行蛋白诱导表达,对表达的重组蛋白用His单抗进行特异性鉴定,并对鉴定后的蛋白应用包涵体洗液进行纯化。最后,以纯化的蛋白通过背部多点皮内注射免疫小鼠和家兔制备多克隆抗体。结果,重组蛋白的分子质量在44ku左右,能够与His单抗发生特异性反应。Western-blot反应证明,制备的鼠和家兔多克隆抗体具有高度的特异性。猪乳转铁蛋白鼠和家兔多抗的制备为猪乳转铁蛋白受体功能的确认和激光共聚焦对其定位提供了技术储备。     

禽戊型肝炎病毒衣壳蛋白多克隆抗体的制备及其在乳酸乳球菌中的表达

将编码禽戊型肝炎病毒(a HEV)衣壳蛋白的ORF2基因片段克隆入原核表达载体p ET-30a(+)中,构建重组质粒p ET-30a(+)-ORF2。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌Rosseta中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后检测目的蛋白表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,应用间接ELISA检测抗体效价。将衣壳蛋白主要抗原区域ORF2Δ250(251~606 aa)基因片段克隆入乳酸菌表达载体p TX8048中获得阳性质粒p TX8048-ORF2Δ250,质粒电转化入宿主菌Lactococcus lactis NZ9000中筛选阳性菌p TX8048-ORF2Δ250/L.lact is NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用West ern-blot检测目的蛋白表达情况。结果表明,a HEV衣壳蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,制备的多克隆抗体效价为1∶216。重组菌p TX8048-ORF2Δ250/L.lactis NZ9000经Nisin诱导后,Western-blot检测到约55 ku的目的蛋白。上述研究结果将为鸡戊型肝炎乳酸菌疫苗研究提供参考。     

绵羊BST-2B基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了表达含有绵羊BST-2B(o BST-2B)基因的重组蛋白,用RT-PCR方法扩增绵羊肺细胞的o BST-2B基因,并将其克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组表达质粒p GEX-4T-o BST-2B。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组o BST-2B蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备抗o BST-2B的多克隆抗体。蛋白免疫印迹分析和间接免疫荧光试验检测结果显示,该抗体具有较好的反应原性。本试验成功制备的o BST-2B蛋白及多克隆抗体,为研究o BST-2B蛋白的生物学功能及羊传染病的致病机制提供了良好的基础材料。     

柔嫩艾美耳球虫AMA1蛋白多克隆抗体的制备及在乳酸乳球菌中的表达

将柔嫩艾美耳球虫子孢子顶膜抗原AMA1胞外域基因片段(EtAMA1)克隆入原核表达载体pET-30a(+)中,构建重组质粒pET-30a(+)-EtAMA1。质粒经鉴定正确后转化入大肠杆菌中筛选阳性菌,阳性菌经IPTG诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。用表达的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。应用间接ELISA测定抗体效价,并采用Western-blot检测抗体特异性。将EtAMA1克隆入乳酸菌表达载体pTX8048中构建阳性质粒pTX8048-EtAMA1,质粒电转化入宿主菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中筛选阳性菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000。阳性菌经Nisin诱导后采用Western-blot检测目的蛋白的表达情况。结果表明,EtAMA1在大肠杆菌中以包涵体形式表达。多克隆抗体的效价为218。Western-blot检测证实,制备的抗体可与子孢子反应。重组菌pTX8048-EtAMA1-L.lactis NZ9000经Nisin诱导后,采用Western-blot检测到约61ku的目的蛋白。上述研究结果为基于EtAMA1的鸡球虫病乳酸菌口服疫苗的研制提供了重要参考。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。