口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆及其在大肠埃希氏菌中的表达

利用RT PCR技术 ,用包容口蹄疫病毒完整VP1基因的引物从口蹄疫分离株 (China/99 2 )中扩增得到一约 75 0bp的DNA片段 ,克隆后 ,经对该片段的核苷酸序列进行测序和同源性比较 ,显示其与国外同源参考序列 (O1K/66)的同源性为 80 .44% ,与国内同型参考株 (HB/WH/99)的核苷酸序列的同源性达 99.0 6%。随后以重组质粒pGEM VP1为模板 ,用特异性表达引物扩增得到目的基因VP1 (65 0bp) ,对目的基因和表达载体 pGEX 4T 1分别以相同的限制性内切酶酶切后构建成重组表达载体 ,转化宿主菌BL2 1 (DE3 )后得到重组质粒pGEX VP1 ,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序证明目的基因正确插入到表达载体。用IPTG诱导VP1基因的表达 ,收集不同时间的菌液进行SDS PAGE电泳、Western blotting分析检测。结果表明 ,结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中表达 ,表达产物的分子量约为 5 3ku ,并能被口蹄疫阳性血清所识别。经薄层扫描分析 ,表达蛋白约占菌体蛋白总量的 2 0 .0 0 %。证明口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因可在大肠埃希氏菌中高效表达 ,且表达产物有一定的生物学活性     

三株O型口蹄疫病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

用抗O型口蹄疫病毒(FMDV)单克隆抗体杂交瘤细胞株(4A9、4C3、9F12)制备腹水并进行纯化,经ELISA检测,单抗4A9、4C3和9F12的腹水效价分别为1:25 600、1:102 400和1:51 200,SDS-PAGE分析显示,3株纯化单抗均以IgG重链和轻链为主,其分子质量分别约为45 ku和25 ku.单抗4A9、4C3和9F12的饱和度分别为1:40、1:40和1:1 000,叠加试验所得增值指数分别为0.27%、13.05%、13.34%,均小于50%.Western-blotting结果显示,3株单抗均可与O型FMDV结构蛋白VP1发生特异性反应.表明,此3株单抗均识别O型FMDV VP1蛋白上的同一个抗原位点,存在干扰现象.     

改良菌落原位杂交技术快速筛选NDVF基因阳性克隆株

应用从表达型质粒载体构建的ＮＤＶＦ基因文库中筛选阳性克隆株的改良融合蛋白质抗体蛋白质原位杂交技术，可使菌落在硝酸纤维素薄膜上增殖，经适当处理后，即可用特异性抗体探针进行原位筛选，获得含目的基因编码的特异抗原蛋白的阳性克隆株。     

应用λgt11载体系统克隆与表达禽源巴氏杆菌的抗原蛋白基因

本研究应用λgt11载体系统构建了禽源巴氏杆菌P1059菌株DNA的表达型基因文库。P1059DNA被机械剪切刀随机剪切成2～8kb大小的片段,其内部EcoRⅠ位点被甲基化后再在片段的两端连接上EcoRⅠ“接头”。然后将用EcoRⅠ酶消化的上述片段连接到λgt11载体臂上,在体外包装成重组噬菌体。将重组噬菌体感染大肠杆菌Y1090,用抗P1059高免家兔血清作为第一抗体,酶标羊抗兔IgG作为第二抗体对噬菌斑进行原位筛选。用筛选出来的7个抗原基因阳性克隆株分别溶原化于大肠杆菌Y1089,在IPTG诱导下使溶原菌表达出β半乳糖苷酶——外源性多肽链融合蛋白质。用惠斯顿免疫吸附试验检测从上述7株溶原菌所获得的融合蛋白质,均显示出特异性的抗原抗体反应。用小鼠作进一步的免疫保护试验证明,有一株溶原菌(PaC_1株)的粗制裂解物能使小鼠对P1059强毒菌的攻击具有较强的抵抗力。     

鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭体内的生长动力学检测

为了研究鸭瘟病毒疫苗株在免疫SPF鸭脑、胸腺、脾、肾、肝、法氏囊中的动态分布规律,根据GenBank中鸭瘟病毒的UL6基因设计引物RTF和RTR,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法,建立了特异性强、敏感性高、重复性好的标准曲线。利用建立的标准曲线对采集组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数进行定量。结果显示,免疫后在脑、胸腺、肝、肾、脾、法氏囊均能检测到鸭瘟病毒DNA,且免疫后第1天至第3周,肝、脑、肾中病毒DNA的拷贝数较其他受检组织中鸭瘟病毒DNA的拷贝数高。免疫后至第9周,鸭瘟病毒DNA检出不稳定。试验结束时,除肾、法氏囊外,其他组织中病毒DNA的拷贝数均下降至1×105copies以下。表明鸭瘟病毒疫苗株对SPF鸭组织具有泛嗜性,其主要分布于SPF鸭脑、肝、肾中。     

狂犬病的分子生物学诊断

从攻击咬伤人并致其死亡的犬脑组织中提取总RNA ,用特异性引物通过反转录聚合酶链反应 (RT PCR)获得了长度约为 14 2 3bp的核酸片段 ,与预期的片段大小相符 ;将扩增产物连接到pMD 18 T 载体中 ,转化大肠埃希氏菌JM 10 9,筛选氨苄青霉素抗性菌落 ,提取质粒 ,经酶切鉴定、PCR分析及测序 ,证明所克隆的 14 2 3bp片段含有完整的狂犬病病毒N基因 ,与国外参考毒株的序列相比同源性较高 ,从而做出正确的诊断。试验表明 ,用RT PCR技术检测狂犬病病毒灵敏度高、特异性强 ,适合于实验室应用     

禽霍乱双型原生质体融合株的筛选及其免疫原性研究

以抗链霉素、对卡那霉素敏感的禽源多杀性巴氏杆菌Ｐ１０５９株（血清型为８Ａ）和抗卡那霉素、对链霉素敏感的Ｃ４８－１株（血清型为５Ａ）为亲本，在脱氧核糖核酸酶Ⅰ（ＤＮａｓｅⅠ）始终存在的条件下，以聚乙二醇（ＰＥＧ，分子量６０００）为助融剂，进行原生质体融合，然后在高渗琼脂平板上再生细胞壁，再转种于含卡那霉素和链霉素的双抗培养基上检出融合株。对筛选获得的２个融合株（简称为Ｆ２和Ｆ６）进一步研究表明，其在形态、染色特性、生化反应和毒力等方面均符合禽源多杀性巴氏杆菌的特性。通过血清型鉴定和双抗药性试验证明两亲本株菌细胞确已发生了原生质体融合和染色体重组，经反复继代培养证明融合株表型稳定。用Ｆ２制备的灭能苗免疫小白鼠，１４ｄ后攻毒，对两型标准强毒菌混合培养物１个ＭＬＤ保护率为１００％，１０个ＭＬＤ保护率为８０％。     

应用肠道微环境重组技术提高家禽抗病力的研究──雏鸡口服乳杆菌XF－9301制剂的安全性和效力试验

应用自制的ＸＦ－９３０１乳杆菌制剂给清净雏鸡群和染疫雏鸡群口服，进行安全试验和效力试验，证实ＸＦ－９３０１制剂是一种安全、有效的微生态制剂。染疫雏鸡群口服ＸＦ－９３０１组与未经处置组１月龄雏鸡存活率及雏鸡白痢等腹泻性疾病发病率间存在着显著差异（Ｐ＜０．０５）。