猪流行性腹泻病毒抗原捕获ELISA抗体检测方法的建立与应用

用猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白单克隆抗体IgG包被酶标板,以纯化的PEDV作为捕获抗原,建立了PEDV抗原捕获ELISA抗体检测方法。优化后该方法的反应条件为:单克隆抗体包被浓度为2μg/mL,37℃包被2h加4℃过夜;含50g/L脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液作为封闭液,37℃封闭3h;捕获抗原的质量浓度为5μg/mL,37℃作用3h;被检猪血清做1∶50稀释,37℃作用1h;山羊抗猪IgG-HRP稀释度为1∶2 000,37℃作用45min;底物最佳作用时间为37℃10min。设定阴阳性血清抗体对照,计算血清样品的S/P值,S/P值≥0.37判为阳性,S/P值0.323判为阴性,介于两者之间为可疑。用建立的ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒和口蹄疫病毒等阳性血清,结果均无交叉反应性。该方法的批间和批内变异系数均小于10%。相对国产商品化抗体检测试剂盒,其敏感性、特异性和符合率分别为94.6%、91.3%和93.3%。应用本方法检测山东、浙江和江苏省的308份猪血清样品,结果 PEDV抗体阳性率达89.29%。结果表明,建立的抗原捕获ELISA敏感性、特异性和重复性良好,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的一种重要病原,GP5蛋白是病毒编码的重要免疫保护蛋白。目前,虽然PRRSV抗体检测方法较多,但尚无商品化的GP5蛋白ELISA抗体检测试剂盒。本研究根据高致病性PRRSV BB0907毒株GP5基因特性,删除了GP5基因跨膜区,并将剩余基因片段优化为大肠杆菌偏嗜性,构建了高效表达的GP5重组蛋白的原核表达载体,制备获得GP5重组蛋白。通过反应条件优化,建立了PRRSV GP5蛋白间接ELISA(GP5-ELISA)抗体检测方法,其最佳抗原包被浓度为1.0μg/m L,血清的最佳稀释度为1:100,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和副猪嗜血杆菌(HPS)等病原抗体均无交叉反应。相对于IDEXX公司PRRSV ELISA抗体检测试剂盒,本研究建立的间接GP5-ELISA的敏感性和特异性分别为90.69%和92.86%,两种方法的符合率为91.11%。用本研究建立的间接GP5-ELISA对360份临床猪血清的PRRSV抗体进行检测,抗体阳性率为74.44%。上述结果表明,本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法具有广阔的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立与应用

本研究为建立一种针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的快速检测方法,根据PRRSV O RF7基因保守区域序列,设计了三对特异性引物。通过Bst D N A聚合酶、引物、Mg2+、d NT Ps和SY BR G reenⅠ及H NB染料浓度等反应条件优化,建立了PRRSV反转录-环介导等温核酸扩增(RT-L AMP)检测方法 ,62℃条件下反应35 min,肉眼可见白色沉淀,1.5%琼脂糖凝胶电泳出现梯形条带,SYBR GreenⅠ染料显示呈绿色。该方法的最低检测限(TCID50)为1×100.5/m L,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻病毒等病原均无交叉反应。110份临床样品检测结果显示,PRRSV阳性率60.0%,与RT-PCR检测结果符合率为85.5%。上述结果说明,该方法操作简便,灵敏特异,可用于PRRSV临床样品的快速诊断。     

基于GIS的境外矿产资源项目管理系统平台总体设计

本文通过对国内外矿产资源项目管理系统平台设计相关研究的分析归纳,探索建立了对境外矿产资源项目的信息管理模型,实现了GIS系统与信息结构系统的融合、工作流技术与GIS的无缝集成、GIS平台、工作流平台与境外矿产资源项目管理的集成等,力图大幅减少境外矿产项目承包的时间成本,提高相关收益,并为项目的整体管理和运营提供合理的依据和措施。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与应用

利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3E5、3E6和5A6。经ELISA测定,它们的培养上清的效价分别为1∶12 800、1∶1 600和1∶6 400,腹水效价分别为1∶6 400 000、1∶640 000和1∶800 000;亚类鉴定结果显示,3株单克隆抗体为IgG2a亚类,轻链为κ型;Western-blot结果显示,3株单克隆抗体均能与PCV2Cap蛋白发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,3株单克隆抗体均能与感染PCV2的PK-15细胞产生特异性荧光反应;病毒中和试验显示,3E5和3E6具有中和活性。利用单克隆抗体3E5建立了检测PCV2抗原的夹心ELISA;它可被用于检测经β-丙内酯灭活的PCV2和杆状病毒表达系统表达的PCV2Cap蛋白。上述研究成果为PCV2感染的诊断和PCV2蛋白功能的研究提供了重要工具和手段。     

猪细小病毒2型VP蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了有效监测猪细小病毒2型(PPV2)的抗体水平,选择PPV2VP蛋白主要亲水区及高抗原指数区进行原核表达。以表达的重组tVP蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA。优化后的反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的工作浓度为1∶20 000,检测的临界值为0.400 5(D450nm≥0.400 5判定为阳性)。特异性试验证明,与猪细小病毒1型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、口蹄疫病毒O型血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性试验变异系数均小于10%。应用此方法对采自江苏省的480份临床血清样本进行了检测,PPV2抗体阳性率为31%。试验结果表明,tVP蛋白能很好地获得表达,以此蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床血清PPV2抗体的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的一种重要病原,GP5蛋白是病毒编码的重要免疫保护蛋白。目前,虽然PRRSV抗体检测方法较多,但尚无商品化的GP5蛋白ELISA抗体检测试剂盒。本研究根据高致病性PRRSV BB0907毒株GP5基因特性,删除了GP5基因跨膜区,并将剩余基因片段优化为大肠杆菌偏嗜性,构建了高效表达的GP5重组蛋白的原核表达载体,制备获得GP5重组蛋白。通过反应条件优化,建立了PRRSV GP5蛋白间接ELISA(GP5-ELISA)抗体检测方法,其最佳抗原包被浓度为1.0 g/m L,血清的最佳稀释度为1∶100,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和副猪嗜血杆菌(HPS)等病原抗体均无交叉反应。相对于IDEXX公司PRRSVELISA抗体检测试剂盒,本研究建立的间接GP5-ELISA的敏感性和特异性分别为90.69%和92.86%,两种方法的符合率为91.11%。用本研究建立的间接GP5-ELISA对360份临床猪血清的PRRSV抗体进行检测,抗体阳性率为74.44%。上述结果表明,本研究建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白间接ELISA抗体检测方法具有广阔的应用前景。     

猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA的建立与应用

利用伪狂犬病病毒(PRV)ZJ01毒株重组gB蛋白及其对应的HRP标记的单克隆抗体,旨在建立一种检测伪狂犬病病毒gB抗体的阻断ELISA。对ELISA反应条件进行了优化,具体为:包被抗原的质量浓度为0.5 g/mL;待检血清的稀释比例为1∶1,孵育条件是37℃作用1 h;酶标单抗的稀释度为1∶15 000,作用时间为37℃0.5 h。ELISA结果的判定标准为:血清样品阻断率PI≥28.67%时判为阳性;PI≤18.27%时判为阴性;18.27%PI28.67%时判为可疑。该ELISA能特异性地识别PRV阳性血清,而与PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV阳性血清无交叉反应性。ELISA的重复性试验表明,批间和批内的变异系数均小于10%。比较试验结果表明,该ELISA的相对敏感性和特异性分别为80.9%和96.4%,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为85.1%。用建立的此ELISA对田间采集的535份猪临床血清样品进行了检测,结果显示,PRV抗体阳性率达61.87%。综上所述,本试验建立的猪源伪狂犬病病毒gB蛋白抗体阻断ELISA具有特异、简单、快速的优点,为建立标准化的检测试剂盒奠定了基础。     

猪白细胞介素21基因的原核表达与多抗血清的制备

为了制备猪白细胞介素21(porcine interleukin-21,pIL-21)的多克隆抗体,采用RT-PCR从猪外周血单个核细胞(PBMC)扩增获得pIL-21基因,然后将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-32a(+)之中,转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,pIL-21以可溶性蛋白形式表达,分子质量为35ku,具有良好的反应原性。经过Ni-NTA镍离子亲和层析纯化,获得纯化的重组蛋白pIL-21。用其免疫BALB/c小鼠制备抗pIL-21血清抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体可与杆状病毒表达的重组Cap-pIL-21、ConA和PHA共刺激的猪PBMC细胞发生特异性反应,ELISA抗体效价可达1∶12 800。上述研究结果为pIL-21的生物学功能研究奠定了重要基础。     

2021—2022年华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

为初步了解我国华东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的流行特点,2021—2022年采集华东地区480份临床疑似PRRSV样品,采用RT-PCR方法检测是否存在PRRSV,统计显示阳性为175份,阳性检出率为38.89%。对来自不同猪场的24个阳性样品的病毒ORF5基因测序,所有检测的毒株均属美洲型,共可以分为4个亚型,其中11个毒株属于高致病性PRRSV(HP-PRRSV)(Sublineage 8.7);6个毒株属于类NADC30毒株亚型（Sublineage 1.8）;4个毒株属于类NADC34亚型（Sublineage 1.5）。病毒GP5蛋白基因测序结果显示,流行毒株GP5蛋白aa3-39及aa185-200两个高变区出现变异。该研究表明我国该地区PRRSV流行毒株存在遗传多样性,基因型复杂,需要引起我们的重视。