丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞饲养层制备的影响

用丝裂霉素C和γ射线对小鼠胎儿成纤维细胞进行处理,观察它们对小鼠胎儿成纤维细胞分裂与存活的影响。结果表明,小鼠胎儿成纤维细胞用不同浓度的丝裂霉素 C或不同强度的γ射线处理一定时间(5μg/mL 4 h、10μg/mL 1~4 h、20μg/mL 1.0~2.5 h 或14 Gy 1 h、21 Gy 1h、28 Gy 1 h),能有效地抑制其分裂,且不影响其活力。     

丝胶对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响研究

精液冷冻保存过程中精子易受氧化应激影响而导致解冻后精液品质下降。丝胶具有良好的抗氧化能力,在精液稀释液中添加丝胶可有效抑制活性氧积累导致的脂质过氧化,减缓精子氧化应激。为了解添加丝胶对地中海水牛精液冷冻保存效果的影响,本研究在冷冻稀释液中添加不同浓度（0、0.25%、0.5%、1%）的丝胶,进行精液冷冻保存。检测冻后精子活力、质膜完整性、顶体完整性及精浆中谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）、总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）水平。结果表明,与未处理组相比,添加0.5%丝胶可提高地中海水牛冻后精子活力、质膜完整性、顶体完整性、GSH-Px酶活性、T-AOC水平（P<0.05）,MDA含量显著降低（P<0.05）。0.25%和1%丝胶添加组精子冻后活力、质量参数和抗氧化能力无显著性影响（P>0.05）。稀释液中添加0.5%丝胶时,冻后精子抗冻标志物HSP70蛋白表达水平极显著高于未添加组（P<0.01）。结果表明,在精液稀释液中加入0.5%丝胶可提高精液的抗氧化能力,使精子免受氧化应激损伤,有效改善地中海水牛精液冷冻后的品质。     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞(PGCs)传代培养的影响,将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养,即A组:基础液+10 ng/mL白血病抑制因子(LIF)+10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);B组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF;C组:基础液+20 ng/mLLIF+10 ng/mL bFGF;D组:基础液+20 ng/mL LIF;E组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF+20ng/mL干细胞因子(SCF);F组:基础液+20 ng/mL LIF+40 ng/mL bFGF+40 ng/mL SCF;G组(对照组):基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞(BEF)饲养层上进行传代培养。结果,原代时,A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组(P<0.05),其中E和F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05),而与B、C、D组差异均不显著(P>0.05);1~8代时,B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05);对照组传代数仅为2代,A组为5代,而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明,在传代过程中,LIF起主要作用,20 ng/mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。     

水牛卵母细胞去核方法的比较

水牛卵母细胞体外成熟22 h后,分别用盲吸法、点击法和纺锤体成像系统(Spindleview System)去核。结果,三者的去核率分别为65．1％、81．8％和95．0％,差异极显著(P< 0．01)。以水牛胎儿成纤维细胞为供体,通过核移植构建的重构胚的融合率、分裂率和囊胚发育率, 在上述3种方法之间均没有显著差异(P>0．05)。认为点击法是一种较为简单、实用和有效的去核方法。     

猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养及传代

对猪卵丘细胞和胎儿成纤维细胞的分离、培养和传代进行了系统研究。结果显示,猪的卵丘细胞生长形成单层需要5~6 d;运用组织块法和酶消化法获得胎儿成纤维细胞单层的生长时间分别为10~11 d和8~9 d。猪的卵丘细胞和胎儿成纤维细胞均可以建立并获得稳定的细胞系,这些方法的应用可为猪体细胞核移植研究提供丰富的供体细胞。     

水牛原生殖细胞核移植的研究

以水牛原生殖细胞(PGCs)为核供体,成熟水牛卵母细胞为受体,采用电融合法和胞质内直接注核法对水牛PGCs的核移植进行了研究.从水牛胎儿的生殖嵴或生殖腺分离得到PGCs,在胎儿成纤维细胞饲养层上传代培养后,进行核移植.结果显示,当采用电融合法时,PGCs核移植的融合率、分裂率、囊胚率和总囊胚率均显著高于胎儿成纤维细胞(P＜0.05);当采用直接注核法进行核移植时,PGCs的核移植囊胚率显著高于胎儿成纤维细胞(P＜0.05),但分裂率差异不显著(P＞0.05).结果表明,水牛PGCs细胞是理想的核移植供体细胞.     

奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达

为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)基因序列(NM_000239.2)设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(12.2kb)。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。     

供体细胞形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植效果的影响

通过采集猪卵巢表面的卵母细胞,经过体外成熟和去核,供体细胞经过分离、培养和传代,注核并构建重构胚胎,融合和激活重构胚胎,以探讨供体细胞的形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植重构胚胎的发育能力和核移植效果的影响。结果显示,表面光滑的卵丘细胞作为供体细胞核移植后的分裂率和囊胚率均显著高于表面粗糙的卵丘细胞(P<0.05),虽然融合率差异不显著(P>0.05)。直径小于15μm的供体细胞核移植后的融合率显著低于直径大于30μm的供体细胞(P<0.05)。直径20～30μm供体细胞核移植后的分裂率与直径小于15μm的供体细胞组的分裂率差异显著(P<0.05),与直径大于30μm的供体细胞组差异不显著(P>0.05)。直径20～30μm的供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高,囊胚率有显著差异(P<0.05)。对不同代数胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现,6～9代成纤维细胞的融合率显著高于3～5代和≥10代的成纤维细胞(P<0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。结果表明,表面光滑的供体细胞有利于重构胚胎的发育,直径20～30μm的供体细胞较适合进行核移植,用传代培养6～9代...     

水牛cMyc基因与穿膜肽TAT的融合表达

为探讨干细胞转录因子与穿膜肽融合表达蛋白对水牛体细胞诱导重编程的可行性,作者对影响水牛cMyc基因穿膜肽融合蛋白表达的因素进行了探索。应用双酶切定向克隆的方法,将水牛cMyc基因CDS(1 350bp)连接到pET-HA2-TAT载体中,构建成pET-cMyc-TAT载体,经酶切、PCR和测序验证,载体构建正确。将pET-cMyc-TAT载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导目的蛋白表达,同时探索了其表达形式、诱导表达IPTG最优浓度和最优时间以及蛋白纯化咪唑洗脱的最佳浓度。结果表明,融合蛋白cMyc-TAT在37℃以包涵体的形式大量表达,IPTG终浓度0.001mmol/L,诱导5h为最佳诱导条件,纯化蛋白最佳咪唑洗脱浓度为145.76mmol/L,纯化蛋白经过Western-blot验证具有抗原性。研究结果为建立转录因子穿膜肽融合蛋白诱导水牛iPS细胞技术体系奠定了基础。