水牛原生殖细胞核移植的研究

以水牛原生殖细胞(PGCs)为核供体,成熟水牛卵母细胞为受体,采用电融合法和胞质内直接注核法对水牛PGCs的核移植进行了研究.从水牛胎儿的生殖嵴或生殖腺分离得到PGCs,在胎儿成纤维细胞饲养层上传代培养后,进行核移植.结果显示,当采用电融合法时,PGCs核移植的融合率、分裂率、囊胚率和总囊胚率均显著高于胎儿成纤维细胞(P＜0.05);当采用直接注核法进行核移植时,PGCs的核移植囊胚率显著高于胎儿成纤维细胞(P＜0.05),但分裂率差异不显著(P＞0.05).结果表明,水牛PGCs细胞是理想的核移植供体细胞.     

大片吸虫ESP对水牛外周血单核/巨噬细胞NO表达的影响

为探讨水牛易感大片吸虫的免疫机理,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离水牛外周血单个核细胞,再经贴壁法纯化单核/巨噬细胞,用Geriss法检测在大片吸虫分泌排泄产物(ESP)或脂多糖(LPS)作用下,水牛外周血单核/巨噬细胞一氧化氮(NO)的表达量。结果显示,大片吸虫ESP或LPS都可单独作用刺激水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO。大片吸虫ESP(0.1、1μg/mL)和LPS(0.1μg/mL)联合作用时水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的量低于LPS(0.1μg/mL)单独作用时的量,差异显著(P<0.05)。大片吸虫ESP(10μg/mL)和LPS(0.1μg/mL)联合作用时水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的量与LPS(0.1μg/mL)单独作用时差异不显著(P>0.05)。结果表明,大片吸虫ESP或其中组分能抑制水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的作用,这可能是水牛易感大片吸虫的一个原因。     

紫外线照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

分析了紫外线 (ultraviolet,UV)照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎卵裂和体外发育的影响。结果发现 ,经UV照射 2 0s和 40s的卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率都极显著低于UV照射 0s和 1 0s的卵母细胞 (P <0 .0 1 ) ,表明UV照射卵母细胞超过 2 0s降低了孤雌激活胚胎的卵裂和体外发育潜力。核移植中UV照射卵母细胞 2 0s后 ,重组胚的卵裂率极显著低于卵母细胞照射 0s和 1 0s时所构建的重组胚 (P <0 .0 1 ) ,但囊胚发育率无显著差异 (P>0 .0 5 ) ;而UV照射卵母细胞 40s时 ,所构建的重组胚的卵裂率和囊胚发育率都明显低于其他各组 ,表明超过 2 0s的UV照射显著降低了重组胚的卵裂和体外发育潜力。研究结果表明 ,核移植中用UV指导卵母细胞去核时UV照射时间应控制在 2 0s以内 ,UV照射 1 0s对核移植胚胎的发育不产生任何负面影响     

牛肠黄74例诊疗小结

牛肠黄是四川省役用牛只常见多发病之一。常因确诊困难,延误病机或失治、误治而造成死亡。现将1972年4月至1977年7月记录较详的74例,初步整理小结如下。(一)一般资料1.动物种类:黄牛38例(占51.4％),水牛34例(占45.9％),乳牛2例(占2.7％)。黄牛、水牛全为役用牛。两者发病率无显著差异。     

住肉孢子虫病免疫学诊断方法的研究

本文以间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光抗体试验(IFA)、斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)等4种免疫方法诊断水牛、黄牛和猪的住肉孢子虫病,检出率分别为77.6％(其中水牛为93.4％,黄牛为65.9％),96.1％(其中猪为59.2％,小牛及青年牛为71.4％,成年牛为97.5％),97.5％和97.8％。其中应用IFA、Dot-ELISA诊断家畜住肉孢子虫病,在国内尚未见有报道。试验表明,免疫学诊断技术是当前对家畜住肉孢子虫病进行生前诊断的主要方法。     

PTD-FNK蛋白对水牛精子的冷冻保护作用

PTD-FNK蛋白可以穿透细胞膜进入细胞内发挥抗凋亡作用,抵抗各种不利因素造成的细胞死亡,但国内未见将其加入水牛精液稀释液抑制精子冷冻凋亡的报道。本试验中,在水牛精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100 nmol/L)的PTD-FNK蛋白,冻后检测精子常规质量指标的同时检测精子凋亡相关基因(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因)mRNA表达和Caspase-3蛋白酶的活性;最后以最优PTD-FNK蛋白浓度批量生产冷冻精液,选择50头广西地方母水牛进行人工授精试验。结果显示:①1 nmol/L组精子质膜完整性和10 nmol/L组精子活力显著高于对照组(P<0.05),1 nmol/L组精子活力和1、10 nmol/L组精子活率极显著高于对照组(P<0.01),而100 nmol/L组精子活率却极显著低于对照组(P<0.01);②1 nmol/L PTD-FNK蛋白显著降低冻后精子Caspase-3 mRNA表达(P<0.05);③人工授精后第60天受胎率达60%,略高于其他研究者取得的受胎率(56.25%,P>0.05)。总之,PTD-FNK蛋白可以显著提高水牛精子冻后质量,其机制之一可能是它显著抑制了冻后精子Caspase-3 mRNA的表达;以PTD-FNK蛋白冷冻的水牛精液实施人工授精后可以取得比现有水平更高的受胎率。     

过表达YY1对水牛早期胚胎发育及DNA甲基化的影响

为了解阴阳因子1(YY1)在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对早期胚胎发育和DNA甲基化的影响,本研究通过受精卵卵胞质注射的方法,将线性化处理的过表达YY1质粒注射到体外受精8～10 h的水牛受精卵中,分析其对水牛早期胚胎发育的影响,并在胚胎发育各个时期检测该基因的表达。同时通过qRT-PCR检测过表达YY1对DNMT1表达的影响来研究DNA甲基化水平。qRT-PCR结果表明,YY1和DNMT1在水牛植入前胚胎的表达模式呈相反的趋势,YY1的表达随着胚胎的发育逐渐增高,囊胚期达到最高,而DNMT1基因在桑葚胚前表达较高,囊胚期表达最低。与空白对照组相比,注射25μg/mL质粒对水牛囊胚发育率无显著影响(P0.05),取得较高的表达EGFP囊胚(33.3%),显著高于5、15、50μg/mL处理组(P0.05);处理组与空白对照组的胚胎分裂率、囊胚发育率、囊胚基因表达率差异均不显著(P0.05)。过表达YY1胚胎在体外受精12 d后仍有囊胚产生。与空白对照组相比,处理组各时期胚胎中YY1和DNMT1表达量均有明显的增加。以上结果表明,过表达YY1对体外受精早期胚胎发育没有影响,但会延迟囊胚的形成。     

供体细胞形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植效果的影响

通过采集猪卵巢表面的卵母细胞,经过体外成熟和去核,供体细胞经过分离、培养和传代,注核并构建重构胚胎,融合和激活重构胚胎,以探讨供体细胞的形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植重构胚胎的发育能力和核移植效果的影响。结果显示,表面光滑的卵丘细胞作为供体细胞核移植后的分裂率和囊胚率均显著高于表面粗糙的卵丘细胞(P<0.05),虽然融合率差异不显著(P>0.05)。直径小于15μm的供体细胞核移植后的融合率显著低于直径大于30μm的供体细胞(P<0.05)。直径20～30μm供体细胞核移植后的分裂率与直径小于15μm的供体细胞组的分裂率差异显著(P<0.05),与直径大于30μm的供体细胞组差异不显著(P>0.05)。直径20～30μm的供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高,囊胚率有显著差异(P<0.05)。对不同代数胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现,6～9代成纤维细胞的融合率显著高于3～5代和≥10代的成纤维细胞(P<0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。结果表明,表面光滑的供体细胞有利于重构胚胎的发育,直径20～30μm的供体细胞较适合进行核移植,用传代培养6～9代...     

牦牛胎儿成纤维细胞的分离培养

采用30d胚龄左右的牦牛胚胎,用2种不同的消化液消化后,将所得的牦牛胎儿成纤维细胞(yak embryonic fibroblasts,YEF)培养于不同血清含量的RPMI1640培养液中,并接种于2种不同材质的培养瓶表面,对YEF的分离方法、培养所需胎牛血清(FBS)添加量和不同基质表面对YEF生长的影响进行了研究。结果表明,含150 mL/L FBS的RPMI1640培养基最适合YEF生长,可传代27次以上;经用RPMI1640和D-Hank’s液配制的2．5 g／L胰蛋白酶消化,所得的YEF的细胞活率差异不显著(P>0．05),其原代细胞在含100 mL／L胎牛血清的RPMI1640培养液中的贴壁率差异极显著(P<0．01);不同生长基质对YEF的形态没有显著影响。     

不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

采用体外成熟的牛卵母细胞 ,经 5 μmol/LIonomycin 5min和 2mmol/L 6 DMAP 5 μg/mLCCB 4h激活 ,分别在TALP M 199(TM ,1∶2 )、BMOC M 199(BM ,1∶2 )和CR1aa培养液内培养 ,2 4h和 3 6h各组卵母细胞的卵裂率分别为5 6.4%、5 5 .6%、5 3 .6%和 72 .0 %、75 .9%、79.0 % ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 8d后囊胚发育率分别为 18.2 %、2 1.4%和 2 9.3 % ,CR1aa内培养孤雌生殖胚的囊胚发育率显著高于TM (P <0 .0 1)。皮肤成纤维细胞构建的重组胚经同法激活后 ,分别在TM、BM和CR1aa内培养 ,2 4h和 3 6hBM和CR1aa内重组胚的卵裂率显著高于TM (4 9.7%、49.8%比 2 0 .5 % ;74.1%、73 .2 %比 5 0 .0 % ) (P <0 .0 1) ;虽然培养 8d后各组胚胎的囊胚发育率无显著差异 ,但CR1aa内重组胚的囊胚发育率稍高 (12 .3 %比 9.8%、11.5 % )。结果表明 ,CR1aa更适合孤雌生殖和体细胞核移植胚胎的体外培养。     

绵羊去透明带卵母细胞的孤雌激活

为探索一种简化的绵羊核移植操作程序,比较了不同浓度离子霉素、两种不同激活方法对保留和去除透明带的绵羊卵母细胞孤雌发育的影响。结果,2.5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活去除透明带卵母细胞时,卵裂率为78.9%,囊胚发育率为13.7%;采用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP方法激活保留透明带的卵母细胞时,卵裂率为88.5%,囊胚发育率为14.7%。在WOWs培养中,对去除和保留透明带的卵母细胞,用5μmol/L离子霉素+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为70.4%和69.2%,用70mL/L无水乙醇+2mmol/L 6-DMAP激活时,卵裂率分别为33.3%和23.0%,离子霉素处理组的卵裂率显著高于无水乙醇处理组。结果表明,透明带的去除与否对卵裂率没有产生影响,但各处理组的卵裂卵均未发育为囊胚。     

小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存的研究

为了探索小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存的有效方法,以5周龄昆明小白鼠的卵巢为材料,分别采用不同的冷冻保护剂、平衡时间、冷冻载体和组织块大小对小鼠卵巢组织进行玻璃化冷冻保存。玻璃化冷冻保存的基本程序:取小白鼠卵巢,切块,玻璃化冷冻。玻璃化冷冻效果评判的方法是解冻玻璃化冷冻保存的卵巢组织块,收集其中的未成熟卵,体外培养和体外受精,观察其体外成熟、体外受精及所形成胚胎的发育能力。结果表明,小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存以卵巢组织块大小为1mm3、以半麦管作为载体、在75mL/LED(EG+DMSO)中平衡15min、以用150mL/L ED玻璃化冷冻液处理3min的方法,冷冻保存效果最好。     

间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊早期胚胎中的表达

为了研究间隙连接蛋白Cx43和Cx45在体外受精绵羊胚胎早期发育过程各阶段的表达情况,利用RT-PCR扩增得到绵羊Cx43(43 ku)及Cx45(45 ku)基因的mRNA,并进行序列测定。收集绵羊未成熟和成熟卵母细胞以及体外受精早期胚胎各发育阶段的卵裂球细胞,通过RT-PCR半定量检测Cx43和Cx45基因的mRNA表达量;通过免疫组织化学方法结合激光扫描共聚焦显微镜检测Cx43和Cx45蛋白在绵羊体外受精的早期胚胎发育过程中的表达情况及表达区域。结果表明,在绵羊卵母细胞成熟过程以及早期胚胎发育的各个时期,Cx43及Cx45在mRNA水平和蛋白水平均有表达;Cx43、Cx45蛋白主要分布在细胞膜表面,在细胞质和细胞核中表达微弱。研究结果为进一步探索Cx43和Cx45在绵羊早期胚胎发育过程中的作用提供了试验数据。     

卵丘细胞对小鼠卵母细胞体外成熟及其后续发育的影响

观察了卵丘细胞共培养对小鼠生发泡期部分裸露(PNO)和裸卵(NO)成熟和发育能力的影响;分别用小鼠、大鼠、猪的卵丘细胞与小鼠PNO和NO进行了共培养。检测了小鼠PNO和NO的减数分裂能力、生发泡构型、受精和胚胎发育能力。结果,PNO、NO的减数分裂能力显著(P<0.05)低于卵丘完整复合体(COCs)的减数分裂能力。COCs中SN型卵母细胞比率显著高于PNO和NO中SN型卵母细胞比率(P<0.05),大部分PNO和NO的卵母细胞核型为NSN型。与对照组相比,与小鼠或大鼠卵丘细胞共培养的小鼠PNO和NO的减数分裂能力没有显著提高,但是与猪卵丘细胞共培养却可以提高小鼠PNO和NO的减数分裂能力。结果表明,猪卵丘细胞能促进小鼠卵母细胞的体外成熟,但并不影响小鼠卵母细胞的受精和胚胎发育。     

西北和西南五省(区)部分地区黄牛 牦牛牛病毒性腹泻/粘膜病血清学监测

从陕西、甘肃、宁夏、青海和四川五省（区）部分地区的黄牛群、牦牛群采集血清,用细胞中和试验检测牛病毒性腹泻／粘膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）抗体,结果黄牛群ＢＶＤ／ＭＤ阳性检出率为４６．１５％,其中宁夏黄牛群的感染率最高（５５．９５％）,其次为甘肃（４１．４８％）和陕西（４０．６０％）;牦牛群ＢＶＤ／ＭＤ的阳性检出率为３０．０８％,其中四川牦牛群感染率最高（３８．４６％）,其次为甘肃（２９．４１％）和青海（２８．００％）。     

人和畜禽的空肠弯杆菌分离培养及带菌状况调查

对195例不同年龄腹泻病人的粪样及656只健康和腹泻畜禽的直肠和泄殖腔拭子进行空肠弯杆菌培养,总检出率为26.1%(222/851).人和畜禽的带菌率分别为健康蛋用鸡为61.0%(61/100),腹泻后备蛋用鸡为53.3%(40/75),健康后备蛋用鸡为22.0%(11/50),腹泻仔猪为88.0%(88/100),健康羔羊为5.7%(6/106),牦牛犊为12.4%(15/121)和0(0/104)腹泻病人为0.5%(1/195).蛋用鸡各组间的带菌率差异极显著(P＜0.01),腹泻后备蛋用鸡的带菌率明显高于健康后备蛋用鸡(P＜0.01),显示后备蛋用鸡腹泻与该菌感染相关.腹泻仔猪的带菌率很高,也提示该菌感染与仔猪腹泻存在一定关系.噻孢霉素对空肠弯杆菌检出率的影响和抗生素药敏性试验结果表明,噻孢霉素不能替代头孢霉素Ⅰ,而头孢哌酮钠(头孢必)可取代Camp-BAP琼脂中的头孢霉素Ⅰ.在100mL/LCO2气体环境中微需氧培养比烛缸内培养空肠弯杆菌检出率高13.0%,显示分离该菌以100mL/L CO2法明显优于烛缸法(P＜0.01).     

广西奶牛隐孢子虫病的流行病学调查

为了调查广西奶牛隐孢子虫病的流行情况,采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对广西9个奶牛场和4个奶牛个体养殖户的1 612头份粪样进行隐孢子虫卵囊的检测,并以基于18SrRNA基因的PCR-RFLP技术对分离的隐孢子虫卵囊进行种类鉴定。结果显示,7个奶牛场发现存在隐孢子虫感染,隐孢子虫阳性粪样为189头份,总感染率为11.72%(189/1 612)。在感染的年龄段上,1～6月龄犊牛的隐孢子虫感染率为21.3%,显著高于7～12月龄的青年牛(9.6%)和大于1岁龄的成年牛(3.8%)(P<0.01)。感染季节以冬季感染较高,但与夏季感染结果相比差异不显著(P>0.05)。PCR-RFLP分析显示,分离的7个隐孢子虫株均为安氏隐孢子虫。调查表明,广西奶牛隐孢子虫虫株以安氏隐孢子虫为主,感染率与河南、江苏、安徽、吉林等省份相似。     

我国部分地区禽波氏杆菌病的血清学调查

对广西、河南、山东3省份17个鸡场的746份血清样品进行了禽波氏杆菌(Bordetellaavium)病的血清学调查。结果表明,该病在我国部分地区普遍存在,70日龄以下商品代和父母代肉鸡血清样品的禽波氏杆菌抗体阳性率较低(平均5.96%);70日龄以上肉种鸡血清样品的阳性检出率较高(平均50.00%),其中广西鸡场的阳性检出率为26.32%(65/247),河南鸡场的阳性检出率为76.76%(109/142),山东鸡场的阳性检出率为87.27%(48/55)。回归分析表明,禽波氏杆菌抗体阳性率与日龄呈显著正相关(r=0.928)。     

抗新城疫病毒因子抗病毒作用的研究

用新城疫病毒（ＮＤＶ）乳化疫苗免疫鸡，从高免卵黄中提取抗新城疫病毒因子，观察其对未免疫和免疫过的新城疫流行鸡群的治疗效果。结果对未免疫的新城疫流行鸡群的保护率为４４％（Ｐ＜０．０５）；对免疫过的新城疫流行鸡群的保护率为８９％（Ｐ＜０．００１）；临床治疗也显示出较好的效果。该因子在冰箱中贮存４ａ不失效。该制剂可能为防治鸡新城疫提供一种新的方法